牛Rybp基因的表达特性分析

赵艳芳 ，张 乐，王亚宁，宁 越，王洪宝,2，昝林森,2

(1 西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100；2 国家肉牛改良中心，陕西 杨凌 712100)

随着经济的发展，人们对食品营养价值的要求也越来越高。牛肉蛋白质含量高而脂肪含量低，氨基酸组成比猪肉更接近人体需要，能提高机体抗病能力，并富含铁、硒、锌、铜、锰等矿物质元素，故越来越受到我国消费者的青睐，有“肉中骄子”的美誉[1-6]。但是随着牛肉需求量的增大，市场牛肉供给不足，牛肉价格持续上涨，如何提高牛肉产量和改善牛肉品质成为广大牛育种工作者关注的热点，对肉牛肌肉组织生长发育调控机制的研究将从分子水平揭示影响肉牛产肉性能和牛肉品质形成的机理，为肉牛的分子育种工作奠定基础。肌肉的生成受一系列蛋白调控，包括原致癌肿瘤蛋白1(Wnt1)、配对盒式蛋白3(Pax3)、配对盒式蛋白7(Pax7)和肌调节因子等[7-8]，其中Pax7调控肌卫星细胞，当肌卫星细胞激活时，未成熟肌细胞和成肌细胞将会增殖分化[9]；Pax3和Pax7影响MRF-4、生肌决定因子(Myogenic regulatory factor,MyoD)、生肌决定因子5(Myogenic regulatory factor 5,Myf5)和肌细胞生成素的表达，而MyoD和Myf5激活肌肉特有基因从而调节前体细胞分化成为肌细胞并形成肌管[10-14]。除了上述转录因子外，表观遗传调节也在肌生成转录调控中发挥着重要作用，两者相互作用从而在肌位点中形成一些重要的信号通路[15]。

RING1和YY1结合蛋白(Ring1 and YY1 binding protein,Rybp)又名死亡效应相关因子(Death effector domain-associated factor,Dedaf)，是Garcia等[16]于1999年利用酵母双杂交技术从小鼠中筛选出的一个由228 个氨基酸残基组成的具有锌指结构域的碱性蛋白质。利用生物物理以及流体动力学技术研究发现，自然状态下Rybp处于非折叠状态，当与蛋白质或DNA相互作用时其构象发生改变，出现自身折叠现象[17]。Rybp能与PcG复合物中环指蛋白1(Ring finger protein 1,RING1)、YY1转录因子(YY1 transcription factor,YY1)及E2F家族转录因子E2F2 (Transcription factor 2,E2F2)和E2F3 (transcription factor 3,E2F3)等成员相互作用，调节转录[18]。Rybp在细胞质和细胞核中均有分布，在人淋巴组织和胎盘内表达量最高[19]。Rybp生物学功能繁多，可与细胞质和细胞核内多个蛋白相互作用，调节细胞凋亡[18]。对模式动物果蝇和小鼠的研究发现，Rybp在胚胎、眼及中枢神经系统的发育过程中发挥着作用[20]。许多研究表明，Rybp与人类恶性肿瘤的发生密切相关[18]。Rybp是多梳基因家族(PcG)中的一员，参与多梳蛋白抑制复合物(PRC1)的组成，并在抑制基因转录、调节胚胎发育以及调控表观遗传等方面发挥着重要作用[21]。

肌肉的生成是一个复杂的生物学过程。研究表明，在肌生成的调控系统中，miRNA也扮演了一定的角色，其通过结合靶标3′-UTR导致mRNA分裂和抑制翻译，从而在转录后水平负调控其靶基因，其中miRNA-29是促肌源性因子，可与转录因子YY1和组蛋白甲基转移酶(EzH2)相互作用[22]。有研究表明，转录因子YY1被核转录因子kappa B(Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells,NF-κB)激活后，聚集EZH2使miRNA-29转录沉默，从而抑制肌肉分化[23-24]。在miRNA-29全基因组转录调控网中，miRNA-29基因可通过与Rybp基因3′-UTR结合而调节Rybp基因的转录水平，因此Rybp基因为miRNA-29基因的靶标之一。功能研究表明，在体外C2C12细胞(小鼠成肌细胞)分化和体内肌肉再生过程中，Rybp表达下调，对骨骼肌的生成起负调控作用[25]。此外，Rybp基因与YY1共同占据一些肌生成位点(肌肉生成相关基因)，其中包括了miRNA-29基因，使其表达沉默，从而构成Rybp-miR-29反馈回路。Rybp基因过表达会在目标位点增大EZH2的含量并促进组蛋白H3K27的甲基化，这暗示Rybp基因可能会促进多梳抑制复合物的补充及稳定。以上研究结果表明，Rybp基因可通过与YY1基因共同作用使miRNA-29基因与其他肌生成位点沉默，从而在肌生成过程中发挥一定的调节器作用[25]。

虽然Rybp基因与骨骼肌生成的关系在小鼠上得到了一定的验证，但Rybp基因在农业动物上的研究很少，仍需要人们进行探索，挖掘其潜在的功能。本试验研究了Rybp基因在秦川牛16种组织的表达谱及在不同月龄肌肉、脂肪组织和不同分化阶段肌细胞中的表达情况，旨在为Rybp基因在牛肌生成中的功能研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

秦川牛组织样品来自西北农林科技大学国家肉牛改良中心良种繁育场，样品包括来自3头24月龄牛的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、睾丸、腹膜脂肪、心包脂肪、背最长肌、里脊、大肠、小肠、瘤胃、网胃、皱胃和瓣胃及6,12,18,24和60月龄的肌肉、脂肪组织，组织样品用液氮速冻后于-80 ℃保存待用。秦川牛成肌细胞由西北农林科技大学国家肉牛改良中心细胞实验室保存。

1.2 秦川牛组织总RNA提取及cDNA合成

采用传统的Tizol法提取牛各组织的总RNA。提取过程为：取少量组织样于研钵中，加入液氮反复研磨；加入 500 μL Trizol，继续研磨混匀后转移至1.5 mL离心管中，室温放置15 min后4 ℃、12 000 r/min离心15 min；取上清，按Tizol总体积1/5的量加入氯仿，剧烈振荡15 s后室温静置5 min； 4 ℃、12 000 r/min离心15 min；取上清加入等体积的异丙醇充分混匀后室温静置10 min，4 ℃、12 000 r/min离心10 min；弃上清，加入1 mL 4 ℃预冷的体积分数75%乙醇，4 ℃、8 000 r/min离心5 min；室温干燥2～5 min；用适量RNase-free水溶解RNA，测定浓度后于-80 ℃保存备用。

使用酶标仪检测所提取总RNA的纯度及浓度，并使用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。以提取的RNA为模板，按照PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(TaKaRa)说明进行cDNA的合成。

1.3 秦川牛成肌细胞RNA的提取及cDNA合成

将秦川牛成肌细胞复苏后采用生长培养基(含体积分数10%牛血清和体积分数1%双抗的F-12/DMEM)培养，待细胞长至80%左右融合时使用分化培养基(含体积分数2%马血清和体积分数1%双抗的F-12/DMEM)培养，每天更换一次培养基，于分化第0,2,4,6,8,10天取细胞样品，采用Trizol法提取RNA，并反转录为cDNA，重复3次。

1.4 Rybp基因实时定量引物及候选内参基因引物的设计与合成

根据NCBI数据库中Rybp基因及4个候选内参基因β肌动蛋白(β-actin,ACTB)、甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、18S rRNA和β-2-微球蛋白(Beta-2-microglobulin,B2M)的基因序列信息(GenBank分别为：XM_015468713.1、HM768303.1、NM_001034034.2、AF176811和XM_001251107.5)，用Primer 5.0软件设计引物 (表1)，交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 所用内参基因和Rybp基因及其引物序列Table 1 Primer sequences of reference genes and Rybp gene

1.5 qRT-PCR扩增

qRT-PCR反应体系20 μL：cDNA(30 ng/μL) 2 μL，正反向引物(均10 μmol/L)各0.4 μL，2×SYBR Premix ExTaqTM(5 U/μL)10 μL，ROX Reference Dye Ⅱ(10 μmol/L) 0.4 μL，ddH2O 6.8 μL, 每个样品技术重复3次，生物学重复3次。qRT-PCR反应程序为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40 个循环。延伸阶段收集信号，从60 ℃到95 ℃，采集熔解曲线荧光信号和达到峰值循环数Ct值。

1.6 内参基因表达稳定性评价

对4个候选内参基因的所有生物学重复和技术重复得到的Ct值进行分析，并通过2个稳定性评估软件(BestKeeper和NormFinder软件)分析候选内参基因的稳定性，表达稳定值越小表示该内参基因越稳定。综合分析以上2种方法的结果，确定最佳内参基因。

1.7 Rybp基因在不同组织表达量的计算

利用ABI 7500实时荧光定量仪测定Rybp基因在16种组织、5个不同发育阶段肌肉和脂肪组织以及不同分化阶段牛成肌细胞中的表达量。以内参基因表达稳定性评价中稳定性最好的基因为内参基因，计算相对表达量(Relative quantity,RQ)，计算公式如下：

RQ=2-[(Ct1-Ct2)-(Ct3-Ct4)]

式中：Ct1和Ct3分别为待测组和对照组目标基因Ct均值；Ct2和Ct4分别为待测组和对照组内参基因的Ct均值。

所有数据以“平均数±标准误(Mean±SD)”表示；用SPSS 17.0软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 内参基因引物及Rybp基因实时定量引物的特异性分析

以秦川牛不同组织的cDNA第一链为模板进行qRT-PCR分析。由图1可见，4个内参基因和Rybp基因溶解曲线都有很明显的单一峰，不存在引物二聚体，说明通过Primer 5.0软件设计的引物特异性强，可以满足后续实时定量试验对引物的要求。

图1 4个内参基因和秦川牛Rybp基因的溶解曲线Fig.1 Melting curves of four reference genes and Rybp gene

2.2 内参基因表达稳定性的评估

2.2.1 内参基因在不同组织中转录水平的变化 由图2可知，各内参基因的表达水平在16种组织中存在一定差异，但在3个重复之间的变异都很小。这说明不同处理条件下内参基因稳定性不同。因此，在不同处理实时定量分析时，有必要确定一个适合的内参基因来研究不同处理条件下某一基因表达时序的差异。

1～16.分别代表睾丸、脾、肺、肝、腹膜脂肪、大肠、肾、皱胃、瘤胃、心包脂肪、小肠、网胃、瓣胃、背最长肌、里脊和心组织。图3同1-16.Testis,spleen,lung,liver,retroperitoneal fat,large intestine,kidney,abomasum,rumen,pericardial fat,small intestine,reticulum,omasum,LDM,tenderloin and heart.The same for Fig.3图2 内参基因不同组织中的峰值循环数Ct值Fig.2 Ct of four reference genes in different tissues

2.2.2 内参基因表达稳定性评价 由表2可知，使用NormFinder软件分析时，GAPDH、B2M、18S rRNA、β-actin的表达稳定值分别为1.542，1.908，1.252和3.451，其表达稳定性的顺序为：18S rRNA>GAPDH>B2M>β-actin。使用BestKeeper软件分析时，GAPDH、B2M、18S rRNA、β-actin的表达稳定值分别为1.48，2.21，3.45和5.00，其表达稳定性的顺序为：GAPDH>B2M>18S rRNA>β-actin。

表2 内参基因的表达稳定性分析Table 2 Expression stability of 4 reference genes

由以上分析可知，NormFinder和BestKeeper软件的分析结果具有一定的差异。NormFinder软件分析结果显示，18S rRNA基因的稳定性最好，GAPDH基因紧随其后;而BestKeeper软件分析结果显示，GAPDH基因的稳定性最好，18S rRNA基因的稳定性排第三，表达稳定值与GAPDH基因相差甚远，且18S rRNA基因在不同组织中转录的Ct值多在10到20之间，与目标基因相差较多，容易产生系统误差。综合以上分析结果可知，以GAPDH基因作为内参基因效果最佳。

2.3 Rybp基因在秦川牛不同组织中的表达

由图3可知，Rybp基因在秦川牛背最长肌、里脊、腹膜脂肪等16种组织中均有表达，但表达量在不同组织间存在显著或极显著差异，Rybp在腹膜脂肪、肝、脾、肺、睾丸中表达量较高，其中在睾丸中的表达量最高，是背最长肌的365倍，与其他组织的表达量有极显著差异；在背最长肌、里脊、心脏中Rybp表达量较低，且差异不显著。

图注上标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下图同

2.4 Rybp基因在不同月龄秦川牛肌肉和脂肪组织中的表达

由图4可知，Rybp基因在6，12，18，24，60月龄秦川牛肌肉组织中的表达量具有一定的差异，其中在6月龄肌肉组织中表达量最低，在60月龄肌肉组织中表达量最高，且极显著高于其他月龄，是6月龄的7倍；在6，12，18，24月龄表达量呈微弱上升趋势，但差异不显著。该结果表明，随着秦川牛月龄的增加，Rybp基因在肌肉中的表达量呈上调趋势。

图4 Rybp基因在秦川牛不同月龄肌肉组织中的相对表达量Fig.4 Expression levels of Rybp cattle muscle tissues at different months

由图5可知，Rybp基因在6，12，18，24，60月龄秦川牛脂肪组织中的表达量具有一定的差异，其中以6月龄脂肪组织中的表达量最高，60月龄脂肪组织中的表达量最低，在6，12，18，24月龄脂肪组织中的表达量分别是60月龄的8.5，6.5，5.6和2.1倍。Rybp基因在6月龄脂肪组织中的表达量极显著高于其他月龄，在12，18月龄的表达量也极显著高于24，60月龄，而12和18月龄及24和60月龄之间也有显著差异。该结果表明，随着秦川牛月龄的增加，Rybp基因在脂肪组织中的表达水平呈下降趋势，尤其从18月龄到24月龄，Rybp基因表达量急剧下降。

2.5 Rybp基因在秦川牛不同分化阶段成肌细胞中的表达

由图6可知，Rybp基因在不同分化阶段秦川牛成肌细胞中的表达量具有一定的差异，在第6天的表达量显著高于第4，8和10天，且极显著高于第0和2天，其中以第0天的表达量最低，第2，4，6，8，10天成肌细胞中的表达量分别是第0天的3.6，5.0，9.9，7.0和4.3倍，可见随着分化时间的延长，Rybp基因表达量先增加后降低。

由图7可知，随着分化培养时间的增加，秦川牛成肌细胞肌管形成数量增加，在第6天时肌管数量达到顶峰，而继续培养到第8，10天时，肌管数量下降但长度增加，表明秦川牛成肌细胞从第0～6天分化能力逐渐增强，之后分化能力减弱，这一变化趋势与Rybp基因在秦川牛成肌细胞不同分化阶段的表

达量的变化趋势相吻合，表明随着秦川牛成肌细胞分化增强，Rybp基因表达量逐渐增加。

图6 Rybp基因在秦川牛不同分化阶段成肌细胞中的相对表达量Fig.6 Expression levels of Rybp at different myogenic differentiation stages

A-F分别为分化第0,2,4,6,8和10天的成肌细胞A-F are the 2,4,6,8 and 10 days of muscle cells differentiation.图7 不同分化阶段秦川牛成肌细胞的分化情况 (40×)Fig.7 Morphologic change of myoblast at different differentiation stages (40×)

3 讨 论

Rybp基因作为多梳(PcG)家族的一员，被证明是MicRNA-29新的靶基因。通过更深入的研究发现，Rybp基因负调控骨骼肌生成，并与YY1基因共同作用[25]。Rybp基因与YY1基因共同占据包括miR-29在内的启动子和增强子位点，从而使其在成肌细胞形成过程中保持沉默，进而形成反馈回路。本试验通过一系列实时定量PCR，着重研究了Rybp基因在秦川牛各个组织、不同月龄肌肉组织和脂肪组织及秦川牛成肌细胞不同分化阶段的表达情况，为进一步分析Rybp基因在秦川牛肌肉生成过程中的功能奠定了基础。

在本研究中，Rybp基因在24月龄秦川牛不同组织中的表达存在显著差异，其中在脾、肺、睾丸中的表达量较高，在背最长肌、里脊、心组织中的表达量较低，而且在睾丸组织中的表达量远远高于其他组织，这与对家蚕5龄3 d(第4次脱皮第3天)幼虫的研究[26]相一致，由此推测Rybp基因可能对牛的繁殖性能有一定作用。而Rybp基因在肌肉组织中的表达量明显低于其他组织，其原因值得进一步探索。Zhou等[25]对小鼠的研究表明，Rybp基因在小鼠肺中表达量最高，在骨骼肌中表达量最低，这一结果与本试验结果基本吻合。Zhou等[25]还指出，虽然Rybp基因在小鼠成熟骨骼肌中表达较少，但是Rybp基因与YY1基因共同高度富集在新形成的独立成肌细胞周围，这也一定程度上暗示其在调节成肌细胞生长分化中的作用。

根据本研究结果，笔者推测Rybp基因可能在牛肌肉生成过程中具有抑制作用。针对Rybp基因关于肌肉生成方面的作用，本试验还检测了Rybp基因在秦川牛不同月龄肌肉组织、脂肪组织和不同分化阶段秦川牛成肌细胞中的表达情况。结果显示，Rybp基因在6,12,18,24和60月龄秦川牛肌肉组织中的相对表达量逐渐增高，在6，12，18，24和60月龄秦川牛脂肪组织中的转录水平逐渐降低，印证了24月龄秦川牛各组织中Rybp基因的相对表达量表现为脂肪组织高于肌肉组织。在牛肌肉组织中，Rybp基因表达量随着秦川牛的生长发育而逐渐增加，而6，12，18和24月龄的秦川牛正值生长期，肌肉生长速率快，而24月龄之后秦川牛肌肉的生长速率下降，肌肉积累速率变慢，表明Rybp基因表达量的增加可能抑制了秦川牛肌肉的积累。在秦川牛成肌细胞分化的不同阶段，成肌细胞从第0～6天分化的肌管数量逐渐增加，第6天后肌管数量不再增加反而减少，但长度增长，而Rybp基因表达量在第0～6天逐渐增加，于第6天达到表达量峰值，从第6天开始Rybp基因表达量逐渐下降，可以看出，当Rybp基因表达量达到峰值时，秦川牛成肌细胞分化减缓甚至不再分化。以上结果在一定程度表明，Rybp基因可能抑制牛的肌生成过程，若能确定Rybp基因对牛肌生成的抑制作用并揭示其作用机制，则可利用转基因技术解除Rybp基因对肌肉生长发育的抑制，即可达到加快肉牛生长速度、提高产肉量的育种目标。

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