CaSR对过氧化氢作用后心肌细胞活性和凋亡影响

闫世林，罗永百，朱浩锋，徐超

研究显示，动脉粥样硬化、心肌梗死、缺血再 灌注、高血压等心血管疾病的发生均与组织中氧自由基有关，正常组织中氧自由基不仅在维持正常氧化平衡状态中有重要作用，在细胞信号转导过程中也发挥重要作用[1-3]。当机体内出现氧化损伤时，细胞内正常的蛋白质、脂质等受到破坏，致细胞功能受损，引起细胞凋亡发生[1-3]。钙超载、细胞凋亡增加等均与心肌细胞氧化损伤有关[4]。钙敏感受体（CaSR）在心肌细胞中表达，能维持细胞内钙离子及其他相关金属离子的稳定，对细胞生长、凋亡等有调节作用[5,6]。研究显示，在缺血再灌注损伤中，心肌细胞中CaSR表达上调，并且与心肌组织氧化损伤和凋亡有关[7]。本研究用过氧化氢处理心肌细胞构建心肌细胞氧化损伤模型，用CaSR抑制剂处理心肌细胞，探讨CaSR在过氧化氢心肌细胞活性和凋亡中的作用，以期为探讨CaSR在心血管疾病中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 大鼠心肌细胞H9C2购自于中国科学院细胞库。RNA提取试剂盒为北京天根产品；蛋白提取试剂盒为美国Thermo产品；二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度检测试剂盒为北京solarbio产品；CaSR抑制剂（NPS2300）为美国MedChemExpress产品；CaSR、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）引物由南京金斯瑞合成；活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved Caspase-3）多克隆抗体、信号转导与转录因子3（STAT3）多克隆抗体、磷酸化信号转导与转录因子3（p-STAT3）多克隆抗体均为美国Abcam产品；丙二醛（MDA）含量检测试剂盒 、超氧化物歧化酶（SOD）含量检测试剂盒为碧云天生物研究所产品；乳酸脱氢酶（LDH）含量检测试剂盒为美国Sigma产品。

1.2 心肌细胞培养 H9C2细胞从液氮中取出以后，迅速放在37℃的水浴中，观察细胞完全融化后，加入细胞培养液（含有10%胎牛血清的DMEM），种植到细胞培养瓶，培养条件为：37℃，5% CO2培养箱。培养2～3 d后，倒置显微镜下观察细胞生长至90%，进行细胞传代。传代方法如下：弃培养液上清，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2次，每个细胞瓶中加入适量的0.25%的胰蛋白酶，使胰蛋白酶能够全部覆盖细胞，在37℃消化1 min。加入细胞培养液，根据实验需求把细胞按照不同比例接种到细胞培养瓶中继续培养。

1.3 细胞分组 H9C2细胞培养至对数期后，用200 μmol/L过氧化氢处理细胞6 h，记为模型组，同时以正常培养不加过氧化氢处理的H9C2细胞为对照组。大鼠心肌细胞H9C2经过40 nM的CaSR抑制剂（NPS2300）作用后12 h再用200 μmol/L过氧化氢处理6 h记为抑制剂组。

1.4 荧光定量PCR检测CaSR水平 取各组细胞，按照每一个50 ml的细胞培养瓶加入1 ml的Trizol放在冰上裂解10 min。加入200 μl的氯仿溶液，震荡反应15 s后，在冰上静置5 min。4℃，12000×g离心10 min，用移液枪吸取上层水相溶液，加入500 μl的异丙醇溶液，混匀后，室温条件下静置10min。4℃，12000×g离心10 min，用75%的乙醇溶液洗涤两次，在RNA沉淀中加入20μL的DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶解后保存在-80℃。取1 μg的RNA合成cDNA，步骤参照反转录试剂盒说明书。荧光定量PCR检测CaSR水平，以GAPDH为内参。实验重复3次，取均值。

CaSR上游引物为5，-TTCGGCATCAGCTTTG TG-3’，下游引物5，-TGAAGATGATTTCGTCTTCC-3’。GAPDH上游引物为5，-CGGAGTCAACGGAT TTGGTCGTAT-3’，

下游引物5，-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAA GAC-3’。

1.5 噻唑蓝（MTT）检测细胞增殖活性 取对照组、模型组、抑制剂组细胞，按照每一个96孔板中加入20 μl的MTT溶液（5 mg/ml），放在37℃培养4 h，将上清液吸除后，每孔中加入150 μl的二甲基亚砜，震荡混合10 min，酶标仪检测490 nm每孔的光密度值（OD值），每组设置6个复孔，重复3次，取均值。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡 取对照组、模型组、抑制剂组细胞，加入蛋白酶消化，收集各组细胞，1000×g离心10 min，弃上清液，用PBS把细胞浓度调整为4×105个/ml。取1 ml的细胞悬浮液，1000×g离心10 min后，与200μL的Binding Buffer混合，依次加入10 μl膜联蛋白 V-FITC和碘化丙啶（PI）5 μl，放置于室温，避光反应15 min，再加入300 μl缓冲液混合后，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.7 LDH、MDA 、SOD水平检测 取对照组、模型组、抑制剂组细胞和培养液上清，分别用二硝基苯肼显色法LDH含量检测试剂盒检测培养液上清中LDH水平，用硫代巴比妥酸法检测MDA水平，黄嘌呤氧化酶法检测SOD水平，步骤参照试剂盒说明书。

1.8 Western blot检测Cleaved Caspase-3、STAT3、p-STAT3水平 取对照组、模型组、抑制剂组细胞，在每个50 ml细胞培养瓶中依次加入80 μl裂解液（PMSF和RIPA按照1:100体积比混合）进行细胞裂解，4℃，12000×g离心10 min，吸取蛋白上清溶液，保存于-80℃。用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。在80 V恒压条件下电泳，肉眼观察溴酚蓝到达距离玻璃板底时停止电泳。在60 mA，4℃转膜80 min。封闭：5%牛

血清白蛋白，室温反应2 h。一抗结合：加入一抗（Cleaved Caspase-3按照1:600稀释、STAT3按照1:800稀释、p-STAT3按照1:600稀释），在4℃反应过夜。二抗结合：放在1:2000倍稀释的二抗中，室温孵育2 h。显色，曝光后，用ImageJ对蛋白进行定量分析，以GAPDH为内参。

1.9 统计学分析 所有实验数据采用SPSS21.0软件进行分析，计量资料用（±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞中CaSR水平比较 对照组、模型组、抑制剂组细胞中CaSR mRNA水平为：1.00±0.12、1.95±0.17、1.42±0.14。模型组、抑制剂组CaSR mRNA水平高于对照组，差异具有统计学意义（P=0.000）。抑制剂组CaSR mRNA水平低于模型组，差异具有统计学意义（P=0.000）。过氧化氢作用后的心肌细胞中CaSR表达上调，而CaSR抑制剂能够抑制过氧化氢诱导的心肌细胞中CaSR表达上调，见表1。

2.2 各组细胞增殖活性和凋亡比较 对照组、模型组、抑制剂组细胞OD值为：0.48±0.04、0.21±0.02、0.36±0.03，细胞凋亡率依次为：（5.92±0.98）%、（39.25±7.16）%、（21.72±1.38）%。模型组、抑制剂组OD值低于对照组，差异具有统计学意义（P=0.000）。抑制剂组OD值高于模型组，差异具有统计学意义（P=0.000）。模型组、抑制剂组细胞凋亡率高于对照组，差异具有统计学意义（P=0.000）。抑制剂组细胞凋亡率低于模型组，差异具有统计学意义（P=0.000）。过氧化氢作用后的心肌细胞增殖活性降低，细胞凋亡增加，而CaSR抑制剂能够减弱过氧化氢诱导的心肌细胞凋亡，见图1、表2。

2.3 各组LDH、MDA 、SOD水平比较 对照组、模型组、抑制剂组LDH水平为：（136.25±17.03）U/L、（342.87±29.64）U/L、（285.46±21.45）U/L，MDA 水平为：（1.58±0.19）nmol/mg、（2.74±0.31）nmol/mg、（2.11±0.13）nmol/mg，SOD水平为：（86.22±8.36）U/mg、（27.49±2.33）U/mg、（48.26±4.27）U/mg。模型组、抑制剂组LDH、MDA水平高于对照组，差异具有统计学意义（P=0.000）。抑制剂组LDH、MDA水平低于模型组，差异有统计学意义（P=0.000）。模型组、抑制剂组SOD水平低于对照组，差异有统计学意义（P=0.000）。抑制剂组SOD水平高于模型组，差异有统计学意义（P=0.000）。过氧化氢能够造成心肌细胞氧化损伤，而CaSR抑制剂能够减弱过氧化氢诱导的心肌细胞氧化损伤，见表3。

表1 各组细胞中CaSR mRNA水平（±s）

表1 各组细胞中CaSR mRNA水平（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.05 ；与模型组比较，bP＜0.05

组别 CaSR mRNA对照组 1.00±0.12模型组 1.95±0.17a抑制剂组 1.42±0.14ab F值 32.428 P值 0.001

2.4 各组Cleaved Caspase-3、STAT3、p-STAT3水平比较 对照组、模型组、抑制剂组Cleaved Caspase-3水平为：0.25±0.03、1.89±0.17、1.24±0.11，STAT3水平为：1.64±0.13、1.68±0.16、1.65±0.14，p-STAT3水平为：0.75±0.06、0.21±0.02、0.32±0.03。模型组、抑制剂组Cleaved Caspase-3水平高于对照组，差异有统计学意义（P=0.000）。抑制剂组Cleaved Caspase-3水平低于模型组，差异有统计学意义（P=0.000）。模型组、抑制剂组p-STAT3水平低于对照组，差异有统计学意义（P=0.000）。抑制剂组p-STAT3水平高于模型组，差异有统计学意义（P=0.000）。过氧化氢能够抑制心肌细胞中STAT3磷酸化，而CaSR抑制剂能够部分拮抗过氧化氢对心肌细胞STAT3磷酸化水平影响，见图2和表4。

3 讨论

图1 流式细胞术检测细胞凋亡结果

表2 各组细胞OD值和细胞凋亡率

表3 各组LDH、MDA 、SOD水平

图2 Cleaved Caspase-3、STAT3、p-STAT3水平检测结果

表4 各组Cleaved Caspase-3、STAT3、p-STAT3水平（±s）

表4 各组Cleaved Caspase-3、STAT3、p-STAT3水平（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.05 ；与模型组比较，bP＜0.05

组别 Cleaved Caspase-3 STAT3 p-STAT3对照组 0.25±0.03 1.64±0.13 0.75±0.06模型组 1.89±0.17a 1.68±0.16 0.21±0.02a抑制剂组 1.24±0.11ab 1.65±0.14 0.32±0.03ab F值 146.799 0.063 149.571 P值 0.000 0.940 0.000

CaSR参与缺氧复氧心肌细胞凋亡过程，用CaSR激动剂处理后降低心功能，加重心肌损伤[8]。在缺血再灌注心肌损伤中，氧化应激导致的心肌组织损伤是其损害正常心功能的重要途径[9]。目前对于CaSR调控心肌细胞凋亡机制的研究尚不十分清楚，线粒体途径、内质网应激、死亡受体途径等是其可能的作用机制[10]。CaSR参与G蛋白-PLC-IP3导致的钙离子超载进而引发线粒体损伤和内质网应激，最终激活Caspase级联反应，活化Caspase-3诱导细胞凋亡发生，另外CaSR还能够调控细胞内丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）等多种信号通路调控心肌细胞凋亡[11,12]。本研究发现，用过氧化氢处理后的心肌细胞中CaSR水平升高，而用CaSR抑制剂（NPS2300）处理后能够成功降低心肌细胞中CaSR水平，本研究结果同之前的研究报道一致，说明CaSR参与心肌细胞氧化应激过程。

正常情况下，机体处于氧化平衡状态，当机体内受到炎症因子、内毒素等刺激后会引起细胞内的氧自由基大量聚集，导致存在于细胞膜上的脂质发生过程氧化，使细胞膜通透性发生改变，原来存在于细胞内的LDH外漏，MDA是不饱和脂肪酸过氧化的产物，其在细胞氧化损伤中表达上调[13,14]。SOD在维持细胞内氧化平衡状态中具有重要作用，能够清除细胞内的超氧阴离子，保护细胞免受氧化损伤[15]。本结果显示，过氧化氢处理后的心肌细胞中MDA水平升高，细胞培养液中LDH水平也升高，而细胞中的SOD水平下降，说明过氧化氢能够诱导心肌细胞氧化损伤，而CaSR抑制剂（NPS2300）处理可缓解心肌细胞氧化损伤，抑制CaSR可降低心肌细胞氧化损伤。

氧化应激会引起细胞凋亡的发生，并且与细胞内多种信号通路的转导有关。Caspase级联反应激活后促进细胞凋亡的发生，而Caspase-3作为Caspase蛋白家族成员之一，其活化后可以生成Cleaved Caspase-3，发挥凋亡执行的作用[16,17]。STAT3信号通路在生物机体内广泛表达，其磷酸化水平升高后标志着STAT3信号通路激活，发挥凋亡抑制的作用[18]。研究表明，CaSR参与心肌细胞凋亡的发生与细胞内Caspase级联反应和STAT3信号通路有关[19,20]。本研究结果显示，过氧化氢作用后的心肌细胞中Cleaved Caspase-3水平升高，细胞凋亡增多，细胞活性降低，STAT3磷酸化水平也降低，而用CaSR抑制剂（NPS2300）处理后细胞中Cleaved Caspase-3部分降低，细胞凋亡减少，STAT3磷酸化水平有所升高，CaSR可能通过促进STAT3信号通路激活从而调控心肌细胞凋亡和氧化应激，而对于其具体的作用机制仍需要进一步验证。

综上，过氧化氢诱导心肌细胞凋亡，降低细胞增殖活性，诱导细胞氧化损伤，而抑制CaSR可以减弱心肌细胞凋亡，增加细胞增殖活性，降低细胞氧化损伤，其作用机制可能与STAT3信号通路的激活有关。本研究只在体外细胞试验中进行了初步探讨，在后续试验中会继续探讨CaSR在体内心肌组织细胞凋亡中的作用，对于其与信号通路的关系需继续验证，本研究明确了CaSR参与心肌细胞氧化应激，与心肌细胞凋亡有关，为后续探讨CaSR在心血管疾病中的作用奠定基础。

参 考 文 献

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