MUC2和TFF3在结肠腺瘤和腺癌组织的表达及意义

朱 蓉，刘振民，邱思芳，张 泉，赵 逵

(遵义医学院附属医院 消化内科，贵州 遵义 563099)

结肠癌的发病率及死亡率居高不下，且发病呈年轻化趋势，严重威胁人类的身体健康。但有关结肠癌的发病机制，至今尚未阐明，研究者们也持有不同的观点，其中最经典的即是“正常粘膜—结肠腺瘤—结肠腺癌”途径。近来，随着肿瘤干细胞理论的提出，许多学者认为，归根结底，结肠癌干细胞才是结肠癌的最终起源和根本[1-2]。当结肠癌干细胞分化减少或是异常分化时都将促进结肠癌的发生和进展。已有研究发现在结肠癌的发生进展过程中，杯状细胞的分化改变惯穿了始终[3-4]，粘蛋白 2( Mucin2，MUC2)和肠三叶因子3(Trefoil Factor Family3，TFF3)作为肠杯状细胞重要分化标志物，在结肠腺瘤和腺癌中表达如何，以及与结肠癌的分化、转移等临床病理特征是否存在关联，二者是否可以作为结肠癌的发生发展和转移判断的预测因子，成为了本研究的主旨内容。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取遵义医学院附属医院2015年1月至2016年12月经外科手术切除的结肠腺癌标本50例和电子结肠镜活检钳取的腺瘤标本15例以及正常结肠标本10例，均经病理证实。结肠腺癌患者的临床特点为：男26例，女24例；年龄27～85岁，中位63岁， 60岁及以上者27例，小于60岁者23例；有淋巴转移者31例，无淋巴转移者19例；伴远处转移者12例，不伴远处转移者38例；腺癌高分化者14例，中分化者27例，低分化者9例；腺癌TNM分期T1+T2期者9例，T3+T4期者41例；腺癌发生于左半结肠者25例，右半结肠者25例。

1.2 纳入标准与排除标准 纳入标准：① 肿瘤原发于结肠；②结肠癌患者术前未经任何放化疗及综合治疗等；③完整的临床资料及随访记录。排除标准：①其它部位的肿瘤发生结肠转移者；②结肠黏液腺癌及印戒细胞癌；③ 术前已进行放化疗及综合治疗等；④ 临床资料及随访不完整者。

1.3 方法 采用免疫组织化学染色法(SP法)检测MUC2和TFF3在各组织标本的表达。标本经10%中性福尔马林液固定，并送至病理科进行石蜡包埋。组织切片(3 μm厚度连续切片)、烤片、脱蜡脱水、3% H2O2抑制内源性过氧化物酶、抗原修复、山羊血清封闭、加一抗(兔抗人MUC2单克隆抗体 1∶200，兔抗人TFF3单克隆抗体 1∶500)、4 ℃过夜、加二抗(抗兔二抗1∶1 000) 、洗涤、DAB显色、苏木素复染、分化、脱水，干燥、中性树胶封片、观察照相。染色判断：显微镜200和400倍放大下分别随机选取5个视野，根据组织细胞的染色强度和染色细胞数进行综合评分[5]：①染色强度评分：无染色，阴性，得0分；浅棕色，弱阳性，得1分；棕色无背景着色或深棕色伴有背景着色，中等阳性，得2分；深棕色不伴背景着色，强阳性，得3分；②阳性染色细胞数评分：无阳性染色细胞，得0分；阳性染色细胞数≤25%，得1分；25%<阳性染色细胞数<50%，得2分；阳性染色细胞数≥50%，得3分。两者相乘即最终评分：0分，为阴性(记0分)；1～2分，为弱阳性(记1分)；3～4分，为中等阳性(记2分)；6～9分，为强阳性(记为3分)。最终结果：记0～1分判定阴性表达：记2～3分判定阳性表达。

1.4 统计学处理 使用SPSS18.0软件包进行数据分析处理，均为计数资料，以率或构成比表示，采用χ2检验，与临床病理特征的相关分析采用Spearman 相关分析法。P<0.05差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 MUC2在正常结肠、结肠腺瘤及腺癌组织的表达 免疫组化染色结果显示，杯状细胞标志物MUC2阳性表达主要在细胞浆内，以核周及核上部尤为显著。正常结肠组织呈强阳性表达、表达较局限，结肠腺瘤呈中等阳性，而结肠腺癌呈弱阳性、表达向肠腔弥散(见图1)。

2.2 TFF3在正常结肠、结肠腺瘤及腺癌组织的表达 免疫组化染色结果显示，杯状细胞标志物TFF3阳性表达也主要位于细胞浆内，以核周及核上部明显。正常结肠组织呈强阳性表达、表达局限于核周，结肠腺瘤呈中等阳性，而结肠腺癌呈弱阳性、表达较为弥漫(见图2)。

A：正常结肠(×200);B:结肠腺瘤(×200);C:结肠腺癌(×200);D：正常结肠(×400);E:结肠腺瘤(×400);F:结肠腺癌(×400)。图1 MUC2在正常结肠、结肠腺瘤及腺癌组织中的表达

A：正常结肠(×200);B:结肠腺瘤(×200);C:结肠腺癌(×200);D：正常结肠(×400);E:结肠腺瘤(×400);F:结肠腺癌(×400)。图2 TFF3在正常结肠、结肠腺瘤及腺癌组织中的表达

2.3 MUC2和TFF3在正常结肠、结肠腺瘤及腺癌组织中的表达趋势 MUC2在正常结肠、结肠腺瘤及腺癌组织中的阳性表达率分别为100%、73.3%、38.0%，TFF3的阳性表达率分别为100%、66.6%、44.0%，二者表达均呈逐渐下降趋势，差异均有统计学意义(P<0.05，见图1～2和表1)。

表1正常结肠、结肠腺瘤及腺癌组织中MUC2和TFF3的表达

检测指标阳性表达率(%)正常结肠组结肠腺瘤组结肠腺癌组χ2PMUC2100(10/10)73.3(11/15)38.0(19/50)15.884<0.001TFF3100(10/10)66.6(10/15)44.0(22/50)11.4720.003

2.4 MUC2和TFF3的表达与结肠癌临床病理特征的关系 统计学分析结果示，MUC2和TFF3的表达均与结肠癌患者年龄、性别、癌发生部位及分化程度无关(P>0.05)，而与结肠癌的TNM分期、淋巴结及远处转移相关(P<0.05)。但有所不同的是MUC2与结肠癌TNM分期、淋巴结及远处转移呈负相关(χ2值分别为9.574、8.233、4.358，P值分别为0.001、0.005、0.014)，而TFF3与之呈正相关(χ2值分别为3.328、3.889、6.158，P值分别为0.030、0.045、0.016)，见表2。

表2 MUC2和TFF3的表达与结肠癌临床病理特征的关

临床病理特征例数MUC2阳性数χ2PTFF3阳性数χ2P性别男女262411180.4270.35912100.1020.487年龄<60岁≥60岁23279100.0230.55511110.2530.414部位左半结肠右半结肠25251090.0850.50012100.3250.388分期T1+T2T3+T49418119.5740.0011213.3280.030分化程度高分化中分化低分化1427961030.2340.89061150.6120.737淋巴结转移有无31197128.2330.0051753.8890.045远处转移有无12381184.3580.0149136.1580.016

3 讨论

结肠癌是人类发病率和死亡率均较高的恶性肿瘤之一，严重威胁人类的身体健康，尤其是晚期转移和术后复发，一直是难以解决的瓶颈问题。有关结肠癌的发生发展，存在多种观点，其中最经典的即是“正常粘膜—结肠腺瘤—结肠腺癌”途径。但近来科学研究者们提出，归根结底，结肠癌干细胞才是结肠癌最终的起源和根本。存在于结肠癌的这一小群干细胞，具有“干性”特征，它们不仅能自我更新，失控性增殖，还具有多向分化潜能[1]。当分化减少或是异常分化时都将促进结肠癌发生和进展。

MUC2作为肠杯状细胞的重要分化标志物，是一种高分子量富含寡糖链的分泌型粘蛋白[6]，是肠道黏液保护的主要成分，正常情况下100%表达于肠道粘膜。已有研究表明MUC2的减少或缺失参与结肠癌发生进展，且可能是结肠腺瘤癌变的一个重要标志物[4]。Velcich A和Selamawit Tadesse等[7-8]研究发现MUC2基因敲除小鼠肠道代谢和炎症发生改变，最终导致肠道肿瘤的发生。本研究免疫组化结果显示，与正常结肠组织相比，MUC2在结肠腺瘤中表达下调，在腺癌中更进一步下调，说明MUC2的表达下调在“正常结肠—结肠腺瘤—腺癌”这一经典机制中可能起着重要的作用，其表达下调可能预测结肠癌的发生，此研究结果与已有文献报道相符[9-10]。

不仅如此，目前已有多项研究表明，MUC2与结肠癌的临床病理特征存在一定联系：马晓娟等[4]研究发现，MUC2 表达情况与结肠癌Dukes分期，淋巴和肝转移呈负相关，而与患者年龄大小、性别、肿瘤分化和部位无关。左晓旭等[9]研究发现，MUC2 表达与结肠癌分期、淋巴结转移和组织类型相关，而与性别、肿瘤大小、血管和淋巴管侵袭无关。本研究结果也表明，MUC2表达与结肠癌患者年龄、性别、癌发生部位及分化程度无关，而与结肠癌TNM分期、淋巴结及远处转移呈负相关。

TFF3也是肠杯状细胞分泌的重要分化标志物，是一种内源性多肽，正常情况下参与肠道粘膜保护和损伤修复。多项研究发现，TFF3在多种肿瘤(包括结肠癌[11]、胃癌[12]、前列腺癌[13]、甲状腺癌[14]等)表达异常。它作为分化标志物表现为肿瘤早期抑癌作用[15]，并且其表达下调与肠上皮化生和不典型增生具有相关性[16]。同时，TFF3也存在潜在的促进结肠癌进展转移的作用：李凤玉等[10]研究发现TFF3在结肠腺瘤和结直肠癌中表达阳性率均较正常减少，且与淋巴结转移和肝转移呈正相关，与患者生存时间呈负相关，而与患者年龄、性别、肿瘤大体类型和大小、分化程度以及病理类型等无关。本研究结果显示，TFF3在结肠腺瘤和腺癌组织表达减少，其表达与结肠癌患者年龄、性别、癌发生部位及分化程度无关，而与结肠癌TNM分期、淋巴结及远处转移呈正相关。

MUC2和TFF3均在结肠腺瘤、腺癌中表达逐渐下调，且二者均是肠杯状细胞分化标志物，说明在“正常结肠——腺瘤——癌变”的过程中，向正常的肠杯状细胞分化减少，二者的联合检测可能更有助于对结肠癌变的早期预测。不仅如此，二者与结肠癌的TNM分期、淋巴结及远处转移相关，由此可能作为判断结肠癌进展和转移的预测因子。但是，二者表达下调的具体调控机制如何，二者具体在结肠癌发生发展过程中的作用及机制又如何，尚需更加深入的研究。

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