超声联合SDF-1微泡对糖尿病性心肌病大鼠心肌损伤的保护作用

王琳琳，李文建，李易明，杨 漪，闫凤琴

(1. 哈励逊国际和平医院，河北 衡水 053100；2. 河北医科大学，河北 石家庄 050017)

随着人们饮食习惯的改变，糖尿病已经成为严重威胁人类健康的疾病之一，并呈现高发病率、高致残率及高病死率的趋势。糖尿病性心肌病(DCM)是糖尿病损伤心血管系统所致的重要并发症之一，其是导致糖尿病患者高病死率的主要原因之一[1-2]。临床上常采用药物控制DCM早期发展，但对于DCM发展过程中心肌纤维化导致心室重塑、心功能不全的治疗效果并不理想。近年研究发现，骨髓间充质干细胞(MSCs )或内皮祖细胞(EPCs)植入受损心肌组织中，通过细胞增殖分化再生，可降低心肌纤维化程度，改善心脏泵血功能[3-4]。但由于血液循环和淋巴引流的原因，大量的干细胞并没有归巢到心脏组织，从而影响干细胞移植的治疗效果。基质细胞衍生因子-1(SDF-1)主要分布在骨骼、大脑、心脏等脏器，其配体CXC族趋化因子受体4(CXCR4)则在MSCs和EPCs表面高度表达。本研究旨在探讨超声联合SDF-1微泡对糖尿病性心肌病大鼠心肌损伤的保护作用，为DCM的治疗提供新思路。

1 实验资料

1.1动物 SPF级SD雄性大鼠40只，体质量300 g左右，河北医科大学实验动物中心，合格证号：1704024。

1.2试剂及仪器 微泡造影剂(意大利Bracco公司)；肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；CXCR4兔抗鼠单抗(美国Abcam 公司)；Trizol RNA抽提试剂、Real-time ScriptTM逆转录试剂盒、SYBR Premix ExTaTM荧光定量PCR试剂盒(日本Takara 公司)；Nanodrop ND-2000(美国Gene 公司)；7500型荧光实时定量PCR仪(美国ABI公司)；超声治疗仪(重庆医科大学超声中心)；蛋白印迹试验装置(美国Bio-Rad公司)。

1.3实验方法 将40只SPF级SD大鼠随机分为5组，每组8只。除空白组外，其余组均参考文献[5]方法制备DCM模型，即大鼠给予高脂饲料喂养4周，第5周开始给予1%链脲佐菌素(STZ)30 mg/kg 腹腔注射1周，第20周后尾静取血测得血糖浓度>16.7 mmol/L为DCM造模成功。造模成功后，SDF-1组经尾静脉输入SDF-1溶液10 ng/kg；SDF-1+超声组经尾静脉输入SDF-1溶液10 ng/kg，然后采用2%戊巴比妥钠1 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，利用超声治疗仪(频率为1 MHz，强度为1 W/cm2)辐照大鼠心前区10 min；微泡+超声组经尾静脉输入含有10 ng/kg SDF-1 的微泡混合液(按照说明书将5 mL生理盐水注入Sono Vue干粉瓶中，使用前用力晃动产生微泡即可)，然后采用2%戊巴比妥钠1 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，利用超声治疗仪(频率为1 MHz，强度为1 W/cm2)辐照大鼠心前区10 min。

1.4检测指标

1.4.1心肌生化指标 干预4 d后，每组随机选取大鼠3只，麻醉后留取血清，分别检测血清中CK、LDH和cTnI含量。

1.4.2心功能指标 干预8周后，腹腔注射2%戊巴比妥钠1 mL/kg麻醉各组大鼠。采用M型超声仪，位于左心室乳头肌短轴切面处测定左心室舒张末期内径(LVIDd)、左心室舒张末压(LVEDP)和左心室射血分数(LVEF)。

1.4.3心肌组织中CXCR4蛋白表达情况 采用Western blot法检测。干预8周后，处死各组大鼠，取心肌组织冷冻研磨后，加入蛋白裂解液提取蛋白并进行蛋白定量。随后将蛋白样品进行10% SDS-PAGE电泳分离，再以300 mA恒流电转印到PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，再加入抗CXCR4单抗4 ℃孵育过夜，次日TBS-T洗涤3次，5 min/次，加入辣根酶标记的二抗室温孵育1 h，再TBS-T洗涤3次，5 min/次，ECL化学发光剂发光检测信号。

1.4.4心肌组织中转化生长因子β1(TGF-β1)mRNA表达情况 干预8周后，处死各组大鼠，取心肌组织冷冻研磨后，加入1 mL TRIzol试剂，反复吹吸后移入EP管中，按照TRIzol试剂盒使用说明提取组织总RNA，分光光度计检测RNA质量和浓度。反转录过程按照TaKaRa试剂说明进行操作。取反转录产物cDNA进行荧光实时定量PCR检测，过程按照TaKaRa试剂说明书进行操作。引物序列：TGF-β1Forward primer：5’-TTGGAGCCTGGACACACA-3’，Reverse primer：5’-GTAGTAGACGATGGGCAGTGG-3’；β-actin Forward primer：5’-CACCCAGACCAATGAAGAT -3’，Reverse primer：5’- CAAATAAAGCCATGCCAAT-3’。上述引物均由大连宝生物技术有限公司合成。反应条件参照TaKaRa试剂说明。实验数据通过相对定量△△Ct法进行分析。

2 结 果

2.1各组大鼠血清生化指标比较 干预4 d后，各组大鼠血清CK、LDH和cTnI水平比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清CK、LDH和cTnI水平比较

2.2各组大鼠心功能指标比较 模型组LVIDd、LVEDP均明显高于空白组(P均<0.05)，LVEF明显低于空白组(P<0.05)；各干预组LVIDd、LVEDP均明显低于模型组(P均<0.05)，LVEF均明显高于模型组(P均<0.05)，其中微泡+超声组各项指标改善情况均明显优于SDF-1组和SDF-1+超声组(P均<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠心功能指标比较

注：①与空白组比较，P<0.05；②模型组比较，P<0.05；③与微泡+超声组比较，P<0.05；1 mmHg=0.133 kPa。

2.3各组大鼠心肌组织中CXCR4蛋白和TGF-β1mRNA表达情况 干预8周后，模型组及各干预组CXCR4蛋白表达水平和TGF-β1mRNA表达水平均明显高于空白组(P均<0.05)，各干预组TGF-β1mRNA表达水平均明显低于模型组(P均<0.05)；微泡+超声组CXCR4蛋白表达水平明显高于其他组(P均<0.05)，TGF-β1mRNA表达水平均明显低于SDF-1组和SDF-1+超声组(P均<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠心肌组织中CXCR4蛋白和TGF-β1 mRNA表达情况

注：①与空白组比较，P<0.05；②模型组比较，P<0.05；③与微泡+超声组比较，P<0.05。

3 讨 论

DCM发病过程中非心肌细胞重塑，导致患者心功能不全及泵血能力下降，引发心力衰竭、休克等并发症[6]。目前研究认为，将骨髓间充质干细胞移植到受损心肌组织周围可抑制心肌纤维组织增生，改善心脏功能[7-8]，但心脏功能改善程度与移植干细胞数量呈正相关[9]。所以，如何阻止移植后的干细胞随血液循环和淋巴引流分布到肺脏、肝脏等脏器，而是归巢到心肌组织周围，是DCM治疗能否成功的关键因素之一。

微泡造影剂作为一种新型转运载体，可携带药物、细胞因子、基因等物质，在一定能量超声辐照下爆破微泡，可在靶组织进行精确释放转运物质，从而达到靶向治疗的目的[10]。本研究参考文献[11]，采用低频超声(频率为1 MHz，强度为1 W/cm2)进行体内干预实验,结果显示干预4 d后各组CK、LDH及cTnI水平比较差异均无统计学意义，表明用1 W/cm2的超声强辐照对于大鼠心肌组织是无损伤、安全的。

SDF-1/CXCR4生物轴可以促进MSCs归巢到受损的心肌组织[12]。Zamani等[13]和Won等[14]研究证实，组织局部释放SDF-1可与MSCs表面的唯一配体CXCR4相互结合，募集MSCs靶向运动，促进其增殖分化修复受损心肌组织。而TGF-β1主要由心肌成纤维细胞和心肌细胞产生，其异常增高可能导致心肌间质纤维化，其参与受损心肌组织重塑过程[15]，TGF-β1mRNA 表达可高低反映组织纤维化程度。 本实验结果显示，干预8周后，各干预组LVIDd、LVEDP均明显低于模型组，LVEF均明显高于模型组，且微泡+超声组各指标改善情况均明显优于SDF-1组和SDF-1+超声组，提示超声结合SDF-1微泡能更有效改善心脏泵血功能。模型组及各干预组CXCR4蛋白表达水平和TGF-β1mRNA表达水平均明显高于空白组，各干预组TGF-β1mRNA表达水平均明显低于模型组；微泡+超声组CXCR4蛋白表达水平明显高于其他组，TGF-β1mRNA表达水平均明显低于SDF-1组和SDF-1+超声组。表明静脉注射SDF-1对DCM大鼠心肌损伤有一定保护作用，但单纯超声辐照并没有增加SDF-1的治疗效果，而含有SDF-1的微泡在超声辐照下爆裂，可增加心肌组织周围SDF-1药物浓度，可更有效保护心肌组织。

综上所述，微泡造影剂在一定能量超声辐照下可精确释放SDF-1，最大限度靶向增加心肌组织周围SDF-1药物浓度，通过SDF-1/CXCR4生物轴作用，将高表达CXCR4的MSCs募集到心肌组织周围，其增殖分化再生，阻止心肌纤维化再塑，增强心脏泵血功能，这对于应用微泡造影剂来介导MSCs的归巢研究提供了强有力的支持，为DCM的治疗提供了一种新思路，有一定的应用前景。

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