禽源多杀性巴氏杆菌毒力基因多重PCR检测方法的建立

何贤发,冯方东，徐一凡，高 博，施文文，薛梦琦，郭伟娜

(安徽科技学院动物科学学院，安徽凤阳 233100)

多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)是一种条件致病菌，能够引起多种动物疾病，包括禽霍乱、猪肺疫和萎缩性鼻炎、牛和家兔出血性败血症等，对全世界畜禽养殖业造成巨大的经济损失[1]。特别是在外界应激条件下，比如气候突变、长途运输、寄生虫感染、营养不良等均可能导致机体抵抗力下降，从而发生多杀性巴氏杆菌的内源性或外源性感染[2]。根据荚膜抗原的不同，多杀性巴氏杆菌主要分为5个血清型(A、B、D、E、F)[3]，其中A血清型主要感染禽类，而B血清型和E血清型与出血性败血症有关，D血清型主要引起猪传染性萎缩性鼻炎。荚膜不仅是血清型分型的依据，还是多杀性巴氏杆菌一种重要的毒力因子，其他毒力因子还包括脂多糖、皮肤坏死毒素及外膜蛋白等。

研究发现，多杀性巴氏杆菌的荚膜和外膜蛋白还具有一定的免疫原性，如外膜蛋白H不仅能与宿主细胞受体相互作用，在感染的起始阶段介导细菌黏附到宿主细胞，而且还是宿主免疫系统重要的靶位点[4]。因此，这些毒力基因的检测对研究多杀性巴氏杆菌致病机制及疫苗研发均具有重要意义。目前，对禽源多杀性巴氏杆菌毒力基因方面的研究较少，并且已有的常规PCR方法每次只能检测单个基因，繁琐费时。多重PCR方法不仅具有普通PCR的高特异性和敏感性等优点，还能同时扩增多个基因片段，快速准确，已用于多种病原的鉴定[5-6]或同种病原多个基因的检测[7-8]。因此，本研究主要是建立一种针对禽源多杀性巴氏杆菌毒力基因的多重PCR方法，为其毒力基因的快速检测及致病机制研究奠定基础，也为进一步筛选保护性抗原及疫苗研制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

鸡源多杀性巴氏杆菌分离株HN-1和CZ-6、番鸭源多杀性巴氏杆菌分离株MD-1(A血清型)、仔猪黄痢大肠埃希菌、鸡白痢沙门菌分离株，均由安徽科技学院动物医学实验室分离保存；PCR扩增试剂盒、琼脂糖、50×TAE缓冲液、DNA Marker DL 1 500等，上海生工生物工程技术服务有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 参考文献[9]中的多杀性巴氏杆菌9个毒力基因引物序列，由通用生物系统(安徽)有限公司合成引物。

1.2.2 毒力基因的PCR扩增及敏感性测定 以番鸭源多杀性巴氏杆菌分离株MD-1株为目的菌，煮沸法提取核酸，并用NanoDrop One超微量紫外分光光度计测定核酸浓度，然后用灭菌水进行10倍系列稀释，分别稀释为10-1、10-2、10-3、10-4等浓度，测定单个毒力基因PCR扩增的敏感性。反应体系25 μL：模板2 μL，2×PCR Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L的上、下游引物各1 μL，灭菌水8.5 μL。反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。

PCR产物用15 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，并由通用生物系统(安徽)有限公司进行测序，测序结果进行BLAST比对分析。

1.2.3 毒力基因多重PCR扩增及优化 将9个毒力基因分5组分别对多杀性巴氏杆菌分离株MD-1进行多重PCR扩增，多重PCR体系1为检测pfhA、oma87和ompH基因，多重PCR体系2为检测hgbB、hgbA和exBD-tonB基因，多重PCR体系3为检测sodC、sodA和nanB基因，多重PCR体系4为检测pfhA和nanB基因，多重PCR体系5为检测sodC、sodA、oma87和ompH基因。

反应体系先按照1.2.2进行PCR扩增，根据扩增结果适当调整引物浓度，扩增较强的基因降低引物用量至0.25 μL、0.5 μL，扩增较弱的基因增加引物用量至1.25 μL、1.5 μL。反应条件同1.2.2。

1.2.4 毒力基因多重PCR方法特异性的测定 采用优化后的多重PCR方法分别对鸡源多杀性巴氏杆菌分离株HN-1和CZ-6，以及仔猪黄痢大肠埃希菌、鸡白痢沙门菌分离株进行毒力基因检测，同时以灭菌水作为阴性对照。PCR产物用15 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.5 毒力基因多重PCR方法敏感性的测定 多杀性巴氏杆菌分离株MD-1的核酸分别进行10-1、10-2、10-3、10-4系列倍比稀释后，各取2 μL作为模板，采用多重PCR方法进行毒力基因检测，以灭菌水作为阴性对照。

1.2.6 毒力基因多重PCR方法重复性的测定 采用多重PCR方法对不同稀释度的多杀性巴氏杆菌分离株MD-1的核酸分别在不同时间进行3次重复性检测。

2 结果

2.1 毒力基因的PCR扩增及敏感性测定结果

多杀性巴氏杆菌MD-1分离株的核酸用超微量紫外分光光度计测定，浓度为1.81×108copies/μL。该菌株毒力基因的PCR扩增结果表明，9个毒力基因均能扩增出与预期大小相符的目的条带(图1)，PCR产物的测序结果经BLAST比对分析，均与禽源多杀性巴氏杆菌相应毒力基因序列相符。

将多杀性巴氏杆菌MD-1分离株的核酸分别稀释为10-1、10-2、10-3、10-4等浓度，然后测定9个毒力基因PCR扩增的敏感性，结果见图2。当模板稀释为10-1、10-2时，均可见目的条带，但稀释至10-3时，即为1.81×105copies/μL，pfhA和sodC目的基因条带不明显；在稀释为10-4浓度，即1.81×104copies/μL时，pfhA和sodC目的基因没有条带，exBD-tonB目的基因有较弱条带，而其他6个毒力目的基因条带明显。

M.DNA标准DL 1 500；1～9.分别为pfhA、nanB、exBD-tonB、hgbB、hgbA、sodC、sodA、oma87和ompH基因的PCR产物；10～18.分别为pfhA、nanB、exBD-tonB、hgbB、hgbA、sodC、sodA、oma87和ompH基因的阴性对照

M.DNA Marker DL 1 500；1-9.PCR products of genes pfhA,nanB,exBD-tonB,hgbB,hgbA,sodC,sodA,oma87 and ompH,respectively; 10-18.Negative controls of genes pfhA,nanB,exBD-tonB,hgbB,hgbA,sodC,sodA,oma87 and ompH,respectively

图1毒力基因PCR扩增结果

Fig.1 PCR amplification results of virulence genes

M.DNA标准DL 1 500；1～9,10～18,19～27,28～36.分别为模板为10-1,10-2,10-3,10-4稀释时，pfhA、nanB、exBD-tonB、hgbB、hgbA、sodC、sodA、oma87和ompH基因的PCR产物；37～45.分别为pfhA、nanB、exBD-tonB、hgbB、hgbA、sodC、sodA、oma87和ompH基因的阴性对照

M.DNA Marker 1 500; 1-9,10-18,19-27,28-36.PCR products of genes pfhA,nanB,exBD-tonB,hgbB,hgbA,sodC,sodA,oma87 and ompH amplified for templates diluted as 10-1,10-2,10-3,10-4,respectively; 37-45.Negative controls of genes pfhA,nanB,exBD-tonB,hgbB,hgbA,sodC,sodA,oma87 and ompH,respectively

图2毒力基因PCR扩增的敏感性测定结果

Fig.2 Sensitivity test results of PCR amplification for virulence genes

2.2 多重PCR扩增及优化结果

多重PCR扩增时反应体系中的上、下游引物用量经调整优化后分别为：pfhA基因1.5 μL，sodC和hgbB基因为0.5 μL，exBD-tonB基因为0.25 μL，其余5个基因均为1 μL，可有效扩增出所有目的条带。

9个毒力基因5种多重PCR体系的扩增结果见图3。由图3可知，多重PCR体系1、3、4、5扩增效果较好，如pfhA、oma87和ompH基因，sodC、sodA和nanB基因组成的3重PCR，pfhA和nanB基因组成的双重PCR，sodC、sodA、oma87和ompH基因组成的4重PCR，均能检测出多种毒力基因，但多重PCR体系2中有非特异性条带，因此选用多重PCR体系1、3、4、5进行特异性和敏感性检测。

2.3 多重PCR方法特异性测定结果

多重PCR体系1、3、4、5对多杀性巴氏杆菌分离株HN-1、CZ-6，以及仔猪黄痢大肠埃希菌、鸡白痢沙门菌分离株的PCR扩增结果分别见图4。由图4可知，2株禽源多杀性巴氏杆菌均扩增出相应的毒力基因，目的条带大小相符；大肠埃希菌和沙门菌分离株没有扩增出条带，表明本研究所建立的4种多重PCR体系特异性较强。

2.4 多重PCR方法敏感性测定结果

多杀性巴氏杆菌分离株MD-1毒力基因多重PCR体系1、3、4、5的敏感性测定结果见图5。由图5可知，多重PCR体系1、3、4的检测敏感性为10-2，即1.81×106copies/μL的核酸，多重PCR体系5甚至可检测至10-3，即1.81×105copies/μL的核酸。毒力基因4种多重PCR体系与单个毒力基因PCR检测的敏感性均一致。

M.DNA标准DL 1 500；1～3.分别为pfhA、oma87和ompH基因的PCR产物；6～8.分别为hgbB、hgbA、exBD-tonB基因的PCR产物；11～13.分别为sodC、sodA和nanB基因的PCR产物；16～17.分别为pfhA和nanB基因的PCR产物；20～23.分别为sodC、sodA、oma87和ompH基因的PCR产物；4、9、14、18、24.分别为多重PCR体系1、2、3、4、5的PCR产物；5、10、15、19、25.分别为多重PCR体系1、2、3、4、5的阴性对照

M.DNA Marker DL 1 500；1-3.PCR products of pfhA,oma87 and ompH genes,respectively; 6-8.PCR products of hgbB,hgbA and exBD-tonB genes,respectively; 11-13.PCR products of sodC,sodA and nanB genes,respectively; 16-17.PCR products of pfhA and nanB genes,respectively; 20-23.PCR products of sodC,sodA,oma87 and ompH genes,respectively; 4,9,14,18,24.Products of multiplex PCR 1,2,3,4 and 5,respecitively; 5,10,15,19,25.Negative control of multiplex PCR 1,2,3,4 and 5,respecitively

图3毒力基因的多重PCR扩增结果

Fig.3 Multiplex PCR amplification results of virulence genes

M.DNA标准DL 1 500；1、6、11、16.分别为菌株HN-1多重PCR体系1、3、4、5的PCR产物；2、7、12、17.分别为菌株CZ-6多重PCR体系1、3、4、5的PCR产物；3、8、13、18.分别为仔猪黄痢大肠埃希菌多重PCR体系1、3、4、5的PCR产物；4、9、14、19.分别为鸡白痢沙门菌多重PCR体系1、3、4、5的PCR产物；5、10、15、20.分别为多重PCR体系1、3、4、5的阴性对照

M.DNA Marker DL 1 500; 1,6,11,16.PCR products of multiplex PCR 1,3,4 and 5 of strain HN-1,respectively; 2,7,12,17.PCR products of multiplex PCR 1,3,4 and 5 of strain CZ-6,respectively; 3,8,13,18.PCR products of multiplex PCR 1,3,4 and 5 forE.colifrom piglets with yellow scour,respectively; 4,9,14,19.PCR products of multiplex PCR 1,3,4 and 5 forSalmonellapullorum,respectively; 5,10,15,20.Negative control of multiplex PCR 1,3,4 and 5,respectively

图4多重PCR方法的特异性检测结果

Fig.4 Specificity test results of multiplex PCR assay

2.5 多重PCR方法重复性测定结果

采用多重PCR体系1、3、4、5分别对不同稀释度的模板在不同时间进行了3次PCR扩增，结果均一致(图略)，表明建立的多重PCR方法重复性较好。

3 讨论

近年来，多杀性巴氏杆菌毒力因子方面的研究较多，主要包括黏附素和定殖因子、铁离子调节和摄取蛋白、唾液酸酶、透明质酸酶、超氧化物歧化酶、毒素、脂多糖、荚膜及多种外膜蛋白等。Tang Xi-biao等[10]和Furian T Q等[11]对猪源和禽源多杀性巴氏杆菌中毒力基因的检测发现，外膜蛋白、黏附素、转铁蛋白、唾液酸酶和超氧化物歧化酶等16个毒力相关基因的检出率均高于90%；Varga Z等[12]对42株鹅源多杀性巴氏杆菌毒力基因的检测发现，铁摄取蛋白相关基因(hgbA，hgbB)存在于所有菌株，而唾液酸酶基因(nanH、nanB)仅在部分菌株检出；Furian T Q等[13]对禽霍乱病例中分离的25株多杀性巴氏杆菌毒力基因检测发现，ompH、oma87、sodC、hgbA、hgbB和nanB等基因的检出率均为100%，pfhA和sodA基因的检出率分别为60%和96%；Khamesipour F等[14]对30株牛源多杀性巴氏杆菌的毒力基因检测发现，23个毒力基因在肺炎肺脏中的分离株中均被检出，但健康肺脏中的分离株只检出16个毒力基因。研究发现[15]，多杀性巴氏杆菌中毒力基因的分布与牛感染后的临床表现有较强地正相关性。由此可知，不同宿主和血清型的多杀性巴氏杆菌中毒力基因的存在情况均会影响其致病性，因此，毒力基因的检测对多杀性巴氏杆菌致病机制的研究极其重要。

M.DNA标准DL 1 500；1～5.模板分别稀释为100、10-1、10-2、10-3和10-4时，多重PCR体系1的PCR产物；7～11.模板分别稀释为100、10-1、10-2、10-3和10-4时，多重PCR体系3的PCR产物；13～17.模板分别稀释为100、10-1、10-2、10-3和10-4时，多重PCR体系4的PCR产物；19～23.模板分别稀释为100、10-1、10-2、10-3和10-4时，多重PCR体系5的PCR产物；6、12、18、24.分别为多重PCR体系1、3、4、5的阴性对照

M.DNA Marker DL 1 500; 1-5.PCR products of multiplex PCR 1 for templates diluted as 100,10-1,10-2,10-3,10-4,respectively; 7-11.PCR products of multiplex PCR 3 for templates diluted as 100,10-1,10-2,10-3,10-4,respectively; 13-17.PCR products of multiplex PCR 4 for templates diluted as 100,10-1,10-2,10-3,10-4,respectively; 19-23.PCR products of multiplex PCR 5 for templates diluted as 100,10-1,10-2,10-3,10-4,respectively; 6,12,18,24.Negative controls of multiplex PCR 1,3,4 and 5,respectively

图5多重PCR方法的敏感性测定结果

Fig.5 Sensitivity test results of multiplex PCR assay

多重PCR方法的优势是能够快速、准确地同时检测多个基因，提高检测效率，节省检测时间，成本低廉，有较强的实践应用价值。目前，已有多种多重PCR方法用于多种病原[5-6]或多个基因[7-8]的检测，但用于多杀性巴氏杆菌毒力基因方面的研究较少，除用于荚膜分型外[16]，对其他毒力基因检测方面的报道更少。Furian T Q等[13]建立了3种多重PCR体系用于多杀性巴氏杆菌毒力基因的检测，但均不能检测ompH基因，而本研究建立的多重PCR体系1和5均可检测该基因。本研究主要是对禽源多杀性巴氏杆菌分离株的9个毒力基因进行PCR检测，最终筛选出4种多重PCR体系用于其中6个毒力基因的检测(pfhA、nanB、ompH、oma87、sodA和sodC)，根据多重PCR体系1、3或多重PCR体系4、5均可检测出这6个基因，并且这些多重PCR方法特异性强，敏感性较高，4种多重PCR体系均可检测至1.81×106copies/μL的核酸，具有可重复性。本研究建立的多重PCR方法有利于禽源多杀性巴氏杆菌中毒力基因的快速检测，从而为其致病机制的研究奠定基础，也为其保护性抗原的筛选和疫苗研制提供参考。

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