高钙含量肽钙螯合物的制备与表征分析

申勇涛，原恺，霍乃蕊*，程稚玲，韩克光，范华，樊玮鑫(.山西农业大学 动物科技学院，山西 太谷 0080；.山西省院士专家服务中心，山西 太原 00000；.山西农业大学 实验中心，山西 太谷 0080)

钙是动物和人体内含量最丰富的无机元素，约占人体质量的1%～2.2%[1]。作为二价矿物营养，Ca2+参与体内骨骼生长、肌肉收缩、神经传导、胞内代谢、心脏功能等许多重要的生理过程[2,3]，是维持机体全面健康的必需常量元素。目前缺钙依然是全球性营养和健康问题，我国尤为严重[4,5]。所以安全、经济、高效补钙制剂的研发随即成为当今社会急需解决的问题。研究表明，肽可增加矿物元素的生物利用度[6,7]，有助于机体对钙的吸收[8]，因此肽钙螯合自然成为促进机体对钙吸收利用的一种有效方法。同为第3代有机钙产品，肽螯合钙在制备机制、转运机制、稳定性及溶解性方面显著优于氨基酸鳌合钙[9]。尽管国内外学者以不同来源的肽来制备肽钙螯合物，但在优化工艺时，几乎均以螯合率，少数以螯合物得率为指标，以螯合物中钙含量为指标的研究极少。作为钙制剂，除生物利用度外，钙含量也是考量其品质的一个重要方面，本研究将综合考虑螯合率、螯合物得率和螯合物中的钙含量，以羊骨胶原肽和CaCl2为原料制备高钙含量的肽钙螯合物，并对其分子量、微观结构、红外光谱、氨基酸组成进行分析。为后续钙螯合胶原短肽的工业化生产、作用及机理研究和应用研究提供参考和奠定基础。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

羊骨胶原肽：由内蒙古锡盟肽好生物制品责任有限公司生产，pH为6.0～6.8，在水中100%溶解，出厂报告中蛋白质含量(以干基计)为98.78%，水分4.54%，灰分2.87%。钙指示剂：4.5 g盐酸羟胺溶解于5 mL蒸馏水，0.5 g铬黑T溶解于95 mL分析乙醇，两种溶液混匀后，保存于棕色瓶。双缩脲试剂：取10 mol·L-1NaOH 溶液10 mL和250 g·L-1酒石酸钾钠溶液20 mL加到一定量蒸馏水中，边搅拌边缓慢加入40 g·L-1硫酸铜溶液30 mL，定容至1 000 mL。其他试剂有CaCl2、无水乙醇和三乙醇胺等。

1.2 仪器与设备

Neofuge23R型台式高速冷冻离心机(上海力申)；JDG-0.2型真空冷冻干燥机(兰州科近)；质谱仪(urfleXtreme MALDI-TOF/TOF)；L-2000型高效液相色谱仪(日立)；Tensor 27型傅里叶变换红外光谱仪(Bruker)；JEOL JEM-6490LV型扫描电子显微镜(日本电子光学)等。

1.3 螯合物制备

工艺路线：胶原肽溶液→加入适量的CaCl2→溶解搅拌→调pH→水浴→旋转蒸发仪40～45 ℃浓缩→8倍体积的无水乙醇沉淀3 h→离心(5 000 r·min-1, 10 min)→真空冷冻干燥(温度为50 ℃，压强为85～100 Pa)→ 胶原短肽-钙螯合物。

设定胶原短肽与氯化钙的质量比分别为l0∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1，胶原短肽浓度为60 mg·mL-1，pH8.0，50 ℃螯合40 min，考察螯合率最高时螯合物中的钙含量。为了得到含钙量高的肽钙螯合物，设定肽钙质量比为1∶1～6∶1，其他条件同上，以螯合率、肽钙螯合物得率、螯合物中钙含量为指标，综合分析，确定较适的肽钙质量比。其他条件同上，以确定的肽钙质量比，在pH6～10范围内确定反应较适pH。以确定的质量比、pH，分别在30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃下螯合，确定较适螯合温度。同理在20～60 min范围内，确定较适螯合时间；最后以确定的质量比、pH、温度和时间，胶原短肽浓度分别为40、60、80、100、120 mg·mL-1，综合分析三个指标，确定较适的短肽浓度。

1.4 指标测定

以确定的工艺进行肽钙螯合反应，取5 mL螯合反应液经无水乙醇沉淀离心后，取上清液加2 mL的三乙醇胺，调节pH至12，加入2～3滴铬黑T指示剂，摇匀，立即用0.1 mol·L-1EDTA溶液滴定，颜色从紫红色变成纯蓝色为终点，记录EDTA的消耗量(mL)，计算出游离钙含量，并按下面的3个公式分别计算：螯合率/%=(M1-M2)/M1×100；螯合物得率/%=M3/M4×100；螯合物中钙含量/%=(M1-M2)/M3×100。式中：M1为钙离子总量/mg，M2为游离钙质量/mg，M3为肽钙螯合物质量/mg，M4为反应中加入胶原短肽和CaCl2的总质量。

1.5 肽钙螯合物分析

扫描电镜分析：取适量短肽及肽钙螯合物的冻干粉样品均匀涂于样盘双面胶上，喷金镀膜处理后放入扫描电镜抽真空，施加一定电压后，在设定倍数下倍下获取扫描图像。电镜扫描条件：高压15 kV；束流6.9×10-2mA；工作距离16.2 mm。

红外光谱分析：在4 000～400 cm-1波段内对样品粉末进行扫描。

飞行质谱分析：用Bruker公司提供的标准品进行校准，由中国医学科学院基础医学研究所完成。

氨基酸组分分析：由山西粮食质量监测中心在常压，22 ℃，40%相对湿度下，依据GB/T5009.124-2003进行，均为实测值。

1）充气膜是一种柔性材料，但是在内压力下，膜内会形成张力刚度，有一定承载力及抗变形能力。膜内压力在满足施工期间的变形和施工人员舒适度的要求即可，否则会增加相关造价。充气膜的变形可以通过找形进行控制，使之变形满足设计要求。

螯合物中短肽含量的测定：用5%TCA依次配制胶原短肽标准溶液，与双缩脲试剂反应，显色后取上清液测OD540值，绘制标准曲线，利用得到的线性方程和双缩脲反应计算SBCP-Ca中的短肽含量。

溶解度测定：取SBCP-Ca的饱和溶液100 mL，在105 ℃烘箱中烘干至恒重，干燥器中冷却后称重，即为溶解度。

2 结果与分析

2.1 肽钙螯合物制备

由图1-1可知，当肽钙质量比为35∶1时，螯合率基本达到最大值73.23%，但此时，螯合物中钙含量仅为1.26%，而本研究是为了得到含钙量相对较高的螯合物，因此，除螯合率外，还应兼顾螯合物中的钙含量以及肽钙螯合物的得率，并将肽钙质量比的研究范围缩小至1∶1～6∶1进行研究。

由图1-2可得，随肽钙质量比的增大，螯合率和螯合物得率相应增加，螯合物中钙含量却呈下降趋势。当肽钙质量比为1∶1时，螯合物中的钙含量最高，达10.50%，但螯合率和得率却最低，故选择2:l为较适比。此时，钙含量虽有所下降，但另两个指标基本接近于最大值，对投入的短肽和CaCl2利用率高。

pH对螫合率、螯合物得率和螯合物中钙含量有较大影响[10,11]，本研究的pH范围为6～10，从图1-3可以看出，随pH的升高，3个指标均先升高后降低，在pH为8时，螯合率和螯合物中的钙含量均达到最大值，所以选取螯合pH为8。

胶原短肽与Ca2十的螯合为吸热反应，适当提高温度有利于螯合反应的进行。但温度过高会使螯合钙分解[12]，使胶原短肽发生羰氨反应，与Ca2+形成竞争；图1-4中，在40 ℃时钙含量和螯合率达到最大值，而肽钙螯合物得率在30～50 ℃基本相同，故选择40 ℃为螯合温度。

由图1-5可知，3个指标的变化趋势相同，30 min均达到最大值，因此选择30 min为反应时间。

由图1-6可知，短肽浓度为120 g·L-1时，虽然螯合率和得率均为最大值，但螯合物中的钙含量最低，胶原短肽浓度在80～100 g·L-1范围内，钙含量基本达到最大值，此后螯合率没有显著性变化，可能是因为反应体系黏度较大，影响了多肽与氯化钙的接触，降低了螯合效果[13]，考虑到成本以及为了获得更多的肽钙螯合物，本研究最终选取90 g·L-1作为制备条件。

2.2 肽钙螯合物分析

2.2.1 扫描电镜结果

在上述确定的较适工艺条件下进行螯合反应，螯合物经8倍体积无水乙醇沉淀，真空冷冻干燥后进行扫描电镜观察，由图2可以看出，所制备的高钙含量的肽钙螯合物色泽比胶原短肽要深。胶原短肽螯合钙离子后，由疏松的片状结构变成了致密颗粒状物质，说明短肽与钙之间发生了螯合。

2.2.2 红外光谱分析

从图3可以看出，SBCP-Ca的红外光谱图与SBCP波形大致一样，但发生了位移，说明螯合后形成了新的化合物。

对红外光谱图进一步分析并总结于表1，说明钙离子主要与短肽游离氨基端的氨基(-NH2)、游离羧基端的羧基(-COOH)以及位于短肽内部的羰基(C=O)发生结合。并且钙的结合引起了肽段结构的变化，羧基中的O及氨基中的N是主要配位原子，胶原肽变成了羧酸盐和铵盐。

2.2.3 飞行质谱分析

样品采用基质辅助激光解吸附飞行时间质谱法(MALDI-TOF)测定分子量分布，结果如图4所示，肽钙螯合物离子强度最大的主峰所对应的质荷比为2 278.69，此为肽钙螯合物主成分的精确分子量。螯合反应前的胶原多肽主峰所对应的质荷比为1 230.57。

2.2.4 SBCP-Ca中的胶原短肽、钙、水分含量及溶解度

根据制作的骨胶原短肽标准曲线，y=0.101 6x+0.001 5(R2=0.999 5)，计算得出Hi-Ca SBCP-Ca中的胶原短肽含量为68.16%。经测定钙含量为9.81%，水分6.44%，溶解度100%。

2.2.5 氨基酸组分分析

采用高效液相色谱分析法对样品的氨基酸组成进行分析，结果见表2，在SBCP和SBCP-Ca中均未检出胱氨酸、组氨酸、酪氨酸和蛋氨酸。除脯氨酸含量在SBCP-Ca中下降外，含量最多的前7种氨基酸相同，且含量变化幅度均不大。

图1 肽钙质量比、pH、温度、螯合时间和短肽浓度对肽钙螯合相关指标的影响Fig.1 Effect of the ratio of peptide to calcium,pH,temperature and short peptide concentration on chelating related indices

图2 羊骨胶原短肽与羊骨胶原短肽-钙螯合物及其扫描电镜图片Fig.2 SBCP and high-calcium SBCP-Ca and their SEM pictures

图3 羊骨胶原短肽与胶原短肽-钙螯合物红外光谱图Fig.3 Infrared spectra of collagen peptides and short peptides with collagen

表1 羊骨胶原短肽与钙离子螯合前后红外光谱分析Table 1 Changes of infrared spectra before and after chelating reaction

图4 羊骨胶原短肽(A)及肽钙螯合物(B)的飞行质谱图Fig.4 Time of flight mass spectrometry of SBCP (A) and SBCP-Ca (B)

3 讨论

继无机钙、有机酸钙、氨基酸螯合钙之后的新生代钙制剂，肽钙螯合物在制备过程中已经完成“食物在胃里消化”、“小肠处氨基酸分泌”、“小肠处螯合反应”，可被小肠直接吸收，因此提高了钙的生物利用度，且螯合物中的肽也保持了抗氧化活性、免疫增强活性等一些原有的活性，故具有双重功效。

本研究中当肽钙质量比在10∶1～35∶1范围内，螯合率呈上升趋势，达到最大值73.23%，但螯合物中钙含量仅为1.26%。且尽管螯合率增加了，但肽没有被充分利用，造成浪费。为此缩小肽钙质量比范围至1∶1～6∶1，结果显示螯合物中的钙含量随着螯合率和得率的增加呈下降趋势。所以为了得到高钙含量的肽钙螯合物，不能单独以螯合率为指标进行工艺优化，需综合考虑各个指标进行工艺参数的测定。

表2 氨基酸成分分析/g·100 g-1Table 2 Amino acid composition analysis

由于钙的掺入，螯合物中的氨基酸含量由原料肽中的85.62 g·100 g-1下降至78.51 g·100 g-1。原料肽和螯合物中的特征性氨基酸基本一样，甘氨酸为其第一氨基酸，但脯氨酸在螯合物中的含量下降，其机理有待研究。

红外光谱分析表明螯合反应引起胶原多肽结构的变化，N-Ca取代了N-H，COOH参与了金属离子的结合形成-COO-Ca，说明肽链羧基中的O及氨基中的N是主要配位原子，螯合部位与其他肽钙螯合物相同[14～16]，形成了羊骨胶原肽羧酸盐和铵盐[17]。飞行质谱结果表明原料肽中含量最多的肽分子的荷质比为1 230.57，肽钙螯合物中的主物质的荷质比则增加至2 278.69。表征分析结果充分说明羊骨胶原肽与钙之间通过反应形成了新的化合物。

4 结论

综合考虑螯合率、螯合物中的钙含量以及螯合物得率，得到高钙含量肽钙螯合物的制备工艺。在此工艺下肽钙螯合形成了新的化合物，该研究结果可为高效、安全有机钙制剂的工业化生产提供理论和技术支持。

参 考 文 献

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