甘氨酸对脂多糖刺激引起的断奶仔猪肠道能量代谢紊乱的影响

余 程， 王秀英， 吴欢听， 张 琳， 刘玉兰， 汪文俊*

（1.中南民族大学生命科学学院，湖北武汉430074；2.武汉轻工大学动物营养与饲料科学湖北省重点实验室，湖北武汉430023）

肠道是重要的消化、吸收器官，也是机体重要的免疫器官，在免疫应激中最易受损（李爽，2013）。脂多糖（LPS）可刺激免疫系统，造成免疫应激（刘玉兰等，2008）。研究发现，LPS刺激可造成胃肠道蠕动减慢，肠黏膜缺血和缺氧（刘坚等，2009）。此外，LPS刺激可导致机体释放过量的炎性细胞因子，产生大量的自由基，造成脂质过氧化反应，而这些变化会破坏线粒体结构完整性和细胞色素氧化酶系统，阻碍呼吸链的电子传递，造成ATP合成障碍，使肠道能量代谢紊乱（李爽，2013；刘坚等，2009）。

甘氨酸（Gly）在传统氨基酸分类上是一种非必需氨基酸，研究表明，日粮中添加Gly对机体的发育起着重要作用，是保证哺乳动物最大生长速率的条件性必需氨基酸（Wu等，2013）。仔猪日粮中添加Gly对提高采食量，增强机体抗氧化能力以及维持肠道完整性有重要意义（Wu等，2013）。Gly可抑制钙蛋白酶的活性，保护细胞免受三磷酸腺苷（ATP）衰竭的影响（谷俊朝等，2005）。 另外，Gly分解后可生成乙酰辅酶A，进一步参与三羧酸（TCA）循环（王镜岩等，2002）。目前关于Gly对肠道能量代谢影响的研究报道较少。本试验通过给断奶仔猪注射LPS建立肠道损伤模型（刘玉兰等，2008），研究日粮中添加Gly对肠道能量代谢水平和LPS刺激导致肠道损伤的影响。

1 材料及方法

1.1 试验材料 Gly和丙氨酸纯度均大于99.5%，购自武汉阿米诺科技有限公司。LPS（大肠杆菌血清型055∶B5）购自Sigma公司，溶于生理盐水，以100μg/kg BW剂量注射。

1.2 试验动物与饲养管理 选择24头健康、体况相近 （7.17±0.41）kg的杜×长×大断奶仔猪[（21±1）d 日龄断奶]，根据体重相近的原则随机分为4个处理组，每组6头猪。饲养周期35 d，预试7 d待仔猪适应试验日粮后，进行正式试验。试验前的驱虫及消毒等程序根据猪场饲养管理规范进行。饲养过程中，仔猪可自由饮水采食。猪舍温度维持25～27℃。

1.3 试验饲粮和设计 参照NRC（1998）仔猪饲养标准配制基础日粮，基础日粮组成及营养水平见表1。在各组饲粮中添加丙氨酸以达到等氮。本试验分为4个处理组，分别为对照组、LPS组、1.0%Gly组和2.0%Gly组。对照组和LPS组饲喂基础日粮，后两组饲喂分别添加了1.0%Gly和2.0%Gly的日粮。正式试验第28天时，LPS组、1.0%Gly组和2.0%Gly组仔猪注射LPS，对照组注射相同剂量生理盐水。

表1 基础日粮组成及营养水平

1.4 肠道样品采集与处理 注射LPS或生理盐水4 h后，仔猪注射戊巴比妥钠，待充分麻醉后进行屠宰，剖开腹腔取空肠和回肠样品置于冰上。剖开小肠，用4℃生理盐水冲洗肠段。待滤纸充分吸干水分后，用载玻片刮取空肠和回肠黏膜，分装至离心管中，冻存待测。

1.5 检测指标

1.5.1 腺苷酸含量的测定 肠道的样品参照李爽（2013）的方法进行前处理，采用反向高效液相色谱系统测定样品中ATP、二磷酸腺苷（ADP）和一磷酸腺苷（AMP）的浓度，标准品也在相同的色谱条件下测定。通过标准品对应的峰面积和浓度建立标准曲线方程，根据所测样品的峰面积计算肠道三种腺苷酸（ATP、ADP和 AMP）含量，以 μg/g黏膜重表示。腺苷酸池（TAN）和能荷（EC）水平的计算参照下述公式（李爽，2013）：

TAN=ATP+ADP+AMP；

EC=（ATP+1/2ADP）/（ATP+ADP+AMP）。

1.5.2 TCA循环关键酶活性的测定 TCA循环关键酶包括柠檬酸合成酶（CS）、异柠檬酸脱氢酶（ICDH） 和 α-酮戊二酸脱氢酶复合体 （α-KGDHC），其酶含量的测定方法与李爽（2013）一致，采用ELISA法进行测定。

1.5.3 能量代谢相关因子mRNA表达量的测定测定的基因包括腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、沉默信息调节因子1（Sirt1）、过氧化物酶体增殖物受体-α 辅激活因子1α（PGC-1α）。组织总 RNA提取、cDNA合成、Real-time PCR参照李爽（2013）的方法。待测基因及内参基因GAPDH的引物见表2。所测基因的mRNA表达量采用2-ΔΔCT计算（Livak 和 Schmittgen，2001）。

表2 基因的引物序列

1.6 统计分析 试验数据采用SPSS 22.0统计软件进行单因素方差分析和LSD多重比较。统计结果用平均值和SEM表示。P≤0.05表示显著差异，0.05＜P≤0.10表示具有差异显著性趋势。

2 结果与分析

2.1 Gly对LPS刺激仔猪肠道能量代谢指标的影响 由表3可知，与对照组相比，LPS刺激导致空肠ATP含量、TAN和EC水平分别下降44.5%、21.2%、19.4%，AMP/ATP比值升高96.1%，回肠ATP、ADP含量和 TAN水平降低21.9%、12.9%、18.0%（P ＜0.05）。 与 LPS组相比，1.0%Gly使空肠TAN水平提高14.9%（P=0.05），有升高空肠AMP含量的趋势 （P＜0.10）；2.0%Gly有提高空肠ATP含量和EC水平的趋势（P＜0.10）。

表3 Gly对LPS刺激仔肠道脏能量代谢指标的影响（以湿重为基础）

2.2 Gly对LPS刺激仔猪肠道TCA循环关键酶活性的影响 由表4可知，与对照组相比，LPS刺激导致空肠 TCA循环关键酶 CS、ICDH和 α-KGDHC的活性分别降低15.0%、13.2%、23.2%，回肠TCA循环关键酶CS、ICDH和α-KGDHC的活性分别降低 24.3%、23.5%、51.8%（P＜0.05）。1.0%Gly有提高回肠α-KGDHC活性的趋势（P＜0.10）；2.0%Gly使空肠 ICDH和回肠 α-KGDHC活性分别提高15.9%和41.3%（P＜0.05），同时有提高回肠CS活性的趋势（P＜0.10）。

2.3 Gly对LPS刺激仔猪肠道能量代谢相关基因mRNA表达的影响 由表5可知，与对照组相比，LPS刺激导致空肠 PGC-1α、回肠 Sirt1和PGC-1α的mRNA表达量分别降低55.0%、18.0%、55.0%（P ＜ 0.05）。 与 LPS组相比，1.0%Gly使空肠 PGC-1α的mRNA表达水平提高64.4%（P ＜ 0.05）；2.0%Gly使空肠 PGC-1α、回肠Sirt1和PGC-1α的mRNA表达水平分别提高51.1%、22.0%、60.0%（P ＜ 0.05）。

表4 Gly对LPS刺激仔猪肠道TCA循环关键酶活性的影响（以蛋白质为基础）

表5 Gly对LPS刺激仔猪肠道能量代谢相关基因mRNA表达的影响

3 讨论

ATP是细胞的重要供能物质，细胞内ATP与ADP可相互转换，进而维持ATP的动态平衡，持续地为细胞提供能量（王镜岩等，2002）。另外，细胞中ATP、ADP和AMP含量的动态变化可调控细胞的代谢过程（王镜岩等，2002）。TAN为三种腺苷酸之和，是描述细胞代谢和能量储备状态的重要参数（杨震国等，2012）。为了衡量细胞中高能磷酸键的多少，1968年Atkinson提出了EC的概念，EC可动态调节细胞的能量平衡（杨震国等，2012）。

本试验中，LPS刺激导致肠道ATP和ADP含量、TAN和EC水平下降，AMP/ATP比值升高，表明LPS刺激阻碍了肠黏膜的能量代谢。刘坚等（2009）研究表明，LPS刺激后肠上皮细胞ATP分解代谢增强，加剧了肠道能量供应不足；Bradley（1979）发现LPS自身及其介导的肠道黏膜组织缺血缺氧和过氧化损伤会破坏线粒体膜结构的完整性，抑制氧化磷酸化相关酶如ATP合成酶和电子传递链中相关酶如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）脱氢酶的活性，进而减少ATP合成，导致机体能量代谢紊乱。本试验结果显示，日粮中添加Gly提高了空肠ATP和AMP含量、TAN和EC水平。Wu等（2013）发现饲粮中约30%的Gly在幼龄仔猪小肠的首过代谢中被降解产能。有研究表明，Gly可通过斯提柯兰氏反应产生乙酸，给宿主特别是肠道上皮细胞提供能量（朱伟云等，2014）。因此，我们推测Gly可被机体利用产能，缓解LPS刺激导致的仔猪肠道能量不足。

TCA是需氧生物体重要的能量生成途径，机体对ATP的需求决定了TCA循环的速率 （王镜岩等，2002）。 CS、ICDH 和 α-KGDHC 是 TCA 循环中的三种关键限速酶，均存在真核细胞的线粒体中 （王镜岩等，2002）。CS是TCA循环的第一个关键限速酶，可催化乙酰辅酶A生成柠檬酸，调控生物体的能量代谢 （史红超和苏铁柱，2011）。ICDHs可依据辅酶分为 NAD-ICDH和NADP（酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）-ICDH，催化异柠檬酸生成α-酮戊二酸 （史红超和苏铁柱，2011）。α-KGDHC是TCA中一个关键调控位点，可催化α-酮戊二酸生成琥珀酰辅酶A（王镜岩等，2002）。

本试验中，LPS刺激导致TCA循环三种限速酶的活性下降，这与李爽（2013）的研究结果类似。本试验结果显示，Gly能显著提高肠道TCA循环三种限速酶的活性，表明Gly能提高TCA循环的反应速率，使机体获得更高的能量供给。有研究发现，LPS刺激产生的自由基可造成TCA循环酶的氧化损伤（Kowaltowski和 Vercesi，1999），而 Gly具有抗氧化能力，可清除肠道的自由基 （杜瑞平等，2015）。因此，我们猜测Gly可能通过清除LPS刺激产生的自由基，进而对TCA循环限速酶起保护作用，最终改善肠道的结构和功能。此外，Gly也可能在机体内分解生成乙酰辅酶A进而激活CS，促进TCA循环（史红超和苏铁柱，2011；王镜岩等，2002）。

AMPK是细胞能量变化的感受器，当机体缺乏能量或营养时，AMP/ATP比值上升，AMPK被磷酸化激活，进而调控相关信号通路使能量恢复至正常水平（王艳等，2013）。AMPK激活后可提高NAD+水平进而影响Sirt1的活性（王艳等，2013）。Sirt1属于去乙酰化酶（Sirtuin）家族，可促进糖异生和脂代谢以及调控胰岛β细胞分泌胰岛素来增加机体ATP的含量 （赵静姝和王蓉，2011）。Sirt1也可催化PGC-1α脱乙酰而使其激活（赵静姝和王蓉，2011）。PGC-1α是一种与能量代谢密切相关的核转录辅激活因子，能通过增强细胞呼吸率和利用能量底物产生能量进而使细胞适应环境的改变（李博等，2011）。

本试验中，LPS刺激显著降低Sirt1和PGC-1α的mRNA表达量，这与Kang等（2015）的结果类似。本试验结果显示，Gly缓解了LPS刺激导致的Sirt1和PGC-1α的mRNA表达量的降低。Gly可能通过直接或者间接调节Sirt1和PGC-1α，从而提高机体产能。试验中LPS刺激和Gly的添加对肠道AMPKα1和AMPKα2的mRNA表达量均无显著影响。研究表明，细胞中ATP含量降低，上升的AMP达到一定水平，才能激活AMPK的活性（王艳等，2013；Wijesekara 等，2006），而本试验中可能是因为仔猪肠道能量变化没有达到AMPK的感受范围，所以其表达量无显著变化。

4 结论

本试验结果表明，Gly可缓解LPS刺激导致的肠道能量代谢紊乱，降低TCA循环关键酶活性以及Sirt1和PGC-1α的mRNA表达量。

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