饲料中总胆碱含量的测定

丛明日，牛军舰

（青岛中维安全检测有限公司，山东青岛 266000）

饲料中的总胆碱以游离态和结合态的形式存在，结合态胆碱主要来源于饲料本身，游离态胆碱主要来自添加的饲料级的氯化胆碱[1]。目前的国标方法NY/T1819[2]采用离子色谱法，但离子色谱仪比较贵，一般实验室通常配置的都是可见——紫外分光光度计，国标GB/T 17481[3]的分光度光度法只能检测预混料中的氯化胆碱，无法满足饲料中的总胆碱的检测。笔者结合婴幼儿食品和乳品中胆碱的测定的方法[4]，用1mol/L的HCl溶液水解过夜提取，甲醇低温沉淀杂质，过滤后浓缩，在低温下加入雷氏盐溶液，生成胆碱雷氏盐的结晶，再进行分光光度法测定。

1 测定的方法原理、仪器设备、试剂和测定步骤

1.1 方法原理

胆碱用1mol/L的HCl溶液提取后，在低温下加入雷氏盐生成胆碱雷氏盐的结晶，用丙酮溶解，定容，将其丙酮溶液在波长520nm下进行分光光度测定。

1.2 试剂

甲醇（分析纯，国药集团）；正丙醇（分析纯，国药集团）；5%雷氏盐（分析纯，国药集团）甲醇溶液：称取5g雷氏盐溶于甲醇，加甲醇稀释至100mL，混匀，置冰箱内保存；1mol/L HCl（分析纯，国药集团）溶液：90ml浓HCl加入到990ml的水中，混匀，放棕色瓶中保存；丙酮（分析纯，西陇化工）；氯化胆碱标准品（纯品，Sigma）。

1.3 仪器设备

RE-2000A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SHA-B水浴恒温振荡器（江苏天由有限公司）；UV mini-1240可见-紫外分光光度计（日本岛津）；TDL-5离心机（上海安亭科学仪器厂）；KQ-500DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；AB204-S电子分析天平（瑞士梅特勒托利多公司）。

1.4 测定步骤

1.4.1 提取 精确称取试样约5g入250mL锥形瓶中，加入50mL1mol/L的盐酸溶液，放在70℃的水浴中过夜震荡，冷却后用水转移定容到100mL容量瓶，用滤纸过滤，得试样提取液。移取50mL溶液于250ml烧杯，用浓NaOH（50%）溶液调pH到8～9，加50mL甲醇，在0℃冰箱放置过夜。过滤样液于500mL平底烧瓶，用甲醇冲洗滤纸使滤液转移完全。于50℃用旋转蒸发仪蒸发浓缩到30ml左右，用水转移到50ml离心管，放置冰箱0℃2h以上（保证溶液彻底冷却），拿出后立即加入5ml 5%的雷氏盐甲醇溶液，然后超声震荡使反应液混合均匀，放入0℃冰箱过夜，以3000r/min离心10min，弃去上层溶液，加入 25ml水，以3000r/min离心5min，弃去上层溶液，加入15ml正丙醇，然后超声1~2min混匀后以3000r/min离心5min，弃去上层溶液，加入15ml正丙醇，以3000r/min离心5min，弃去上层溶液，用氮气将沉淀完全吹干。

1.4.2 试样的测定 向沉淀准确加入10ml丙酮，超声摇匀样液。离心5min，转速为3000r/min，取上层清液，用有机滤头过滤至1.0cm比色皿中，以丙酮作参比，在520nm波长下，用分光光度计测定吸光度，在工作曲线上查得试样中氯化胆碱的含量。同时做空白。

1.4.3 工作曲线的绘制 将氯化胆碱标准品盛于称量瓶中于103℃烘干，置于干燥器中冷却至室温。准确称取2g（精确至0.0001g）于100mL容量瓶中，加水溶解后用水定容至刻度，摇匀。精密移取10ml于100ml容量瓶中，用水定容摇匀。分别移取 0.5mL，1ml，2ml，3ml，4ml，5ml，6ml溶液于 50ml离心管中，加水补足到15ml，放置冰箱0℃2h以上（保证溶液彻底冷却），拿出后立即加入5ml5%的雷氏盐甲醇溶液，震荡使反应液混合均匀，放入0℃冰箱过夜，以3000r/min离心10min。弃去上层溶液，加入25ml水，以3000r/min离心5min，弃去上层溶液，加入10ml正丙醇，然后超声1～2min混匀，以3000r/min离心5min，弃去上层溶液，加入10ml正丙醇，以3000r/min离心5min，弃去上层溶液，用氮气将沉淀完全吹干，按照1.4.2测量各标准溶液的吸光度，绘制工作曲线。

1.5 测定结果的计算

从标准曲线上查得测定时所取试样液中氯化胆碱的含量，再根据称样量和稀释倍数计算出样品的含量。

2 结果和讨论

2.1 线性方程和相关系数

以吸光度为横坐标，浓度为纵坐标，绘制标准曲线。

在0.1g/L~1.2 g/L浓度范围内线性良好，线性回归方程为Y=0.5442X+0.0077，相关系数 R=0.9992。

2.2 方法的精密度实验

分别对三种饲料产品进行了6次实验，检测结果，如表1。

表1 三种饲料产品实验检测结果

三种不同的样品的检测结果的RSD均小于5%，说明方法的重复性可以达到检测的要求。

2.3 方法的加标回收率实验

准确称取2g样品，加入2g/L的标准溶液1ml，进行检测计算加标回收率。根据样品的含量计算本底值为2.23mg，扣除本底，计算回收率，如表2。

6次加标回收率均大于95%，提取比较完全，准确结果比较准确。

2.4 pH值的选择

将提取液调到不同的pH，最后通过检测结果确认胆碱稳定的最佳pH范围，根据表3的数据确认，最佳的pH范围为8~9。

表2 加标回收率

表3 pH值范围运算

表4 不同时间沉淀效果

2.5 净化时间的选择

采用加入甲醇放到冰箱中，对蛋白、淀粉等杂质进行沉淀净化后，再过滤掉杂质。时间过长会影响实验效率，时间过短会影响净化效果，通过表4中不同的时间沉淀效果，确认沉淀所选的最少时间为2h。

3 结论

该方法稳定，提取比较完全，达到95%以上，检测结果比较可靠，只是用到一般实验室都有的可见——紫外分光光度计，成本低，同时具有较好的重复性和再现性，可以代替离子色谱法，能广泛应用于各类饲料中总胆碱的含量检测。

[1]王吉峰.饲料中的胆碱[J].饲料工业,1997,18(04):16

[2]NY/T 1819-2009.饲料中胆碱的测定 离子色谱法[S].

[3]GB/T 17481-2008.预混料中氯化胆碱的测定[S].

[4]GB 5413.20-2013.食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中胆碱的测定[S].