雷氏丹参片对斑马鱼肠下血管和节间血管损伤模型的保护作用

李小雪， 陈 昕， 苏海波， 方延廷， 李屹龙， 俞佳利， 孙琳洁， 薛金贵*

(1.上海中医药大学附属曙光医院心内科，上海 201203；2.上海雷允上药业有限公司，上海 201499)

动脉粥样硬化性心血管疾病是严重威胁人类健康的一类疾病，发病率和死亡率一直居高不下，给家庭和国家医疗卫生带来了沉重经济负担。虽然近些年来动脉粥样硬化性心血管疾病的预防和治疗已取得重大进展，但仍由许多动脉粥样硬化性心血管疾病患者不适合有创性血运重建，或血运重建后存在残余狭窄，迫切需要其它创新的治疗方法加以补充[1]。治疗性血管新生已被证明可以重建缺血心脏组织的血管，减少组织梗死的进展，并避免侵入性外科手术或组织/器官移植，是动脉粥样硬化性心血管疾病患者治疗的有益补充[2]。中药丹参中含有的药效成分是内皮细胞、血管平滑肌、心肌细胞和免疫细胞中许多受体的潜在靶点，通过影响细胞的增殖、分化、迁移或分泌，发挥预防、抑制早期事件以及改善动脉粥样硬化性心血管疾病发展的作用[3-4]。本实验研究雷氏丹参片在斑马鱼模型上促血管新生作用，为雷氏丹参片活血化瘀、改善微循环、保护内皮细胞等治疗心脑血管病提供理论依据。

1 材料

1.1 动物 清洁级Tg(fli-1a：EGFP)y1斑马鱼、野生型斑马鱼，由上海中医药大学附属龙华医院斑马鱼实验室提供并饲养,实验动物生产许可证号SCXK(沪)2018-0004。

1.2 试剂与药物 雷氏丹参片浸膏粉(上海雷允上药业有限公司,批号180718),1 g雷氏丹参片浸膏粉相当于1.10～1.16 g生药量。PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；内皮细胞生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(endothelial cell growth receptor tyrosine kinase inhibitorⅡ,VRI)(美国Selleck公司, 批号S1040)；TRIpure(批号1166716500)、cDNA合成试剂盒(批号4897030001)、SYBR Green Master(批号4913914001)均购自上海罗氏制药有限公司。

1.3 仪器 斑马鱼养殖系统(北京爱生科技发展有限公司)；荧光倒置显微镜(日本尼康公司)；荧光定量PCR仪(上海罗氏公司)；多功能酶标仪(瑞士Tecan公司)。

2 方法

2.1 雷氏丹参片毒性实验 使用正常健康受精24 h的野生型斑马鱼，放入每孔含1 mL饲养液的24孔板中,每组10条。用胚胎培养液稀释雷氏丹参片，制成质量浓度为0.1、1、3、10、30、100、300 μg/mL的混悬液,分别加入24孔板中,于28.5 ℃恒温培养箱中培养,以仅加培养液组为空白对照组,培养5 d,每天定时使用荧光倒置显微镜下拍照观察斑马鱼的状态并记录。

2.2 雷氏丹参片干预斑马鱼肠下血管新生实验 使用正常健康受精24 h的Tg(fli-1a：EGFP)y1斑马鱼,镊子除去胚胎软壳,将其饲养于24孔板中,每孔8条,每组2个复孔。用胚胎培养液稀释雷氏丹参片至3、10、30、100 μg/mL，作为加药组,以仅加培养液组为空白对照组，放入28.5 ℃培养箱中培养24 h,吸弃旧培养液,重新加入培养液和不同质量浓度的雷氏丹参片，培养48 h后在荧光倒置显微镜下观察雷氏丹参片在不同质量浓度下对斑马鱼肠下静脉血管(SIVs)的影响。斑马鱼肠下血管出芽数=血管出芽数×1,斑马鱼肠下血管交叉数=血管交叉数×1。

2.3 雷氏丹参片干预VRI诱导斑马鱼肠下血管损伤实验 使用正常健康受精24 h的Tg(fli-1a：EGFP)y1斑马鱼幼鱼,将其饲养于24孔板中,每孔8条,每组3个复孔。以100 nmol/L VRI为培养液,然后用培养液稀释雷氏丹参片质量浓度为3、10、30、100 μg/mL，为加药组,放入28.5 ℃培养箱中,以不加VRI的培养液组为空白对照组，药物干预24 h后观察雷氏丹参片在对斑马鱼SIVs的影响。

2.4 雷氏丹参片干预VRI诱导斑马鱼节间血管损伤实验 使用正常健康受精24 h的Tg(fli-1a：EGFP)y1斑马鱼幼鱼,将其饲养于24孔板中,每孔8条,每组2个复孔。按“2.3”项下方法分组，药物干预24 h后在荧光倒置显微镜下观察雷氏丹参片在对斑马鱼节间血管的影响。斑马鱼节间血管统计方法=完整血管数×1+不完整血管数×0.5。

2.5 实时荧光定量PCR法检测斑马鱼体内mRNA的表达 选择正常健康受精24 h的斑马鱼幼鱼，饲养于24孔板中,每组12条，分为空白对照组、模型组、VRI+雷氏丹参片组和雷氏丹参片组，以100 nmol/L VRI为培养液,然后用培养液稀释雷氏丹参片质量浓度为100 μg/mL。药物作用24 h后,使用TRIpure提取各组斑马鱼总RNA,转录因子cDNA合成试剂盒将RNA反转录为cDNA作为模板,SYBR Green Master进行定量PCR。扩增条件为95 ℃预变性10 min；95 ℃变性20 s，60 ℃退火30 s,72 ℃延伸15 s,40个循环。检测VEGF、flt-l、kdr、kdrlmRNA表达,以GAPDH为内参基因,2-△△CT法计算相对表达，引物序列见表1。

表1 引物序列

3 结果

3.1 雷氏丹参片对斑马鱼生存率的影响 使用不同质量浓度雷氏丹参片进行培养,当质量浓度达到300 μg/mL时,培养到第3天后斑马鱼开始出现死亡,到第5天全部死亡,其他质量浓度斑马鱼正常存活,说明雷氏丹参片的安全剂量为100 μg/mL及100 μg/mL以下，见图1。

3.2 雷氏丹参片对正常斑马鱼肠下血管的影响 与空白对照组比较,各剂量雷氏丹参片组出芽数和交叉点均无明显变化(P>0.05)；各剂量雷氏丹参片可促进斑马鱼直径生长(P<0.05)，见图2、表2～3。

图2 雷氏丹参片对正常斑马鱼肠下血管的影响(×4.5)

表2 雷氏丹参片对正常斑马鱼肠下血管直径的影响

3.3 雷氏丹参片对VRI抑制斑马鱼肠下血管生长障碍的影响 与空白对照组比较,模型组斑马鱼肠下血管出芽数及直径无明显变化(P>0.05)，交叉点数减少(P<0.05)；与模型组比较,各剂量雷氏丹参片组斑马鱼肠下血管出芽数无明显变化(P>0.05)，交叉点数和直径增加(P<0.05)，见图3、表4～5。

图3 雷氏丹参片对VRI抑制斑马鱼肠下血管生长障碍的影响(×4.5)

表3 雷氏丹参片对正常斑马鱼肠下血管出芽数和交叉点的影响[M(QL,QU)]

表4 雷氏丹参片对VRI抑制斑马鱼肠下血管直径的影响

3.4 雷氏丹参片对VRI抑制斑马鱼节间血管生长障碍的影响 与空白对照组比较,模型组和0.1 μg/mL雷氏丹参片组斑马鱼节间血管直径减少(P<0.01)，1、10、100 μg/mL雷氏丹参片组无明显变化(P>0.05)；与模型组比较,1、10、100 μg/mL雷氏丹参片组斑马鱼节间血管直径增加(P<0.01),0.1 μg/mL雷氏丹参片组无明显变化(P>0.05)，见图4～5。

图4 雷氏丹参片对VRI抑制斑马鱼节间血管生长障碍的影响(×4.5)

表5 雷氏丹参片对VRI抑制斑马鱼肠下血管出芽数和交叉点的影响[M(QL,QU)]

3.5 雷氏丹参片对VRI抑制斑马鱼中VEGF及其受体表达的影响 与空白对照组比较，模型组斑马鱼中kdr、flt-1 mRNA表达降低(P<0.05)；与模型组比较, VRI+雷氏丹参片组和雷氏丹参片组斑马鱼中kdr、flt-1 mRNA表达均升高(P<0.01),VRI+雷氏丹参片组斑马鱼中VEGF、kdrlmRNA表达无明显变化(P>0.05),雷氏丹参片组斑马鱼中kdrlmRNA表达升高(P<0.05),见图6。

注：与空白对照组比较,*P<0.05,**P<0.01; 与模型组比较,##P<0.01。图5 雷氏丹参片对VRI抑制斑马鱼节间血管生长障碍的影响

注：与空白对照组比较,**P<0.01; 与模型组比较,#P<0.05,##P<0.01。图6 雷氏丹参片对VRI抑制斑马鱼VEGF、kdrl、kdr、flt-1 mRNA表达的影响

4 讨论

血管新生作为冠心病的内科治疗手段,已成为治疗冠心病的一种可能,并在心血管疾病中表现出了积极的治疗作用[5]。斑马鱼作为一种整体动物模型,基于其成本低廉、与人类基因同源性高、方便快速筛选等特点,已成为心血管研究领域的理想动物模型[6]。丹参作为传统中药,其有效成分具有抗凝血、扩张冠状动脉、改善微循环等多种药理作用,被广泛用于治疗心血管疾病,包括心肌梗死、心绞痛和动脉粥样硬化等,能够改善患者的临床症状[7-9]。丹参及其成分参与调控血管新生, 徐杰等[10]研究发现丹参水溶性有效成分丹参多酚酸盐，能够促进单核细胞诱导的内皮细胞迁移，并促进单核细胞合成和分泌VEGF、bFGF。丹参素可增强缺血后的新生血管形成,以及血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子标记蛋白的表达[11]。丹酚酸B可增加心肌组织VEGF、Nrf2和HO-1的表达促进大鼠缺血心肌血管再生[12]。丹参酮ⅡA可通过VEGF信号通路在缺血性斑马鱼模型中发挥促血管新生和血管保护作用[13]。雷氏丹参片采取水、醇双提取工艺,提取其水溶性的丹参酚酸类和脂溶性的丹参酮类成分, 在临床冠心病心绞痛患者的治疗中具有显著疗效[14]，张春伶等[15]系统分析联合雷氏丹参片治疗冠心病安全有效, 且具有调节血脂的作用，但是关于雷氏丹参片治疗冠心病的具体作用机制的研究仍较缺乏。

本实验以中医理论为指导,研究雷氏丹参片在斑马鱼模型上的促血管新生作用及其作用机制,发现雷氏丹参片质量浓度在100 μg/mL及100 μg/mL以下是安全可靠的；雷氏丹参片可以促进斑马鱼肠下血管的生长,斑马鱼肠下血管的出芽数和直径均增加,具有促进血管新生的作用,不管是新生毛细血管的数量还是管腔直径均增加；在药物抑制血管生长模型中,加入雷氏丹参片后斑马鱼肠下血管交叉点的数量增加；对于斑马鱼节间血管生成不足的模型,给予不同质量浓度丹参片,均能够促进斑马鱼节间血管的生长。本实验结果表明，在一定条件下,雷氏丹参片对受损血管具有修复与保护作用。对斑马鱼体内VEGF受体检测结果显示,雷氏丹参片组和VRI+雷氏丹参片组均表现了对flt1、kdr、kdrl的促表达作用,说明雷氏丹参片促血管新生作用,可能与干预VEGF/VEGFR信号通路有关。