跑台运动通过增加MicroRNA-126改善高脂饮食诱导的肥胖大鼠血运重建

李 靖



跑台运动通过增加MicroRNA-126改善高脂饮食诱导的肥胖大鼠血运重建

李 靖

（巢湖学院体育学院，安徽，合肥 238000）

探讨跑台运动对高脂饮食诱导的肥胖大鼠MiRNA-126表达和骨骼肌血运重建的影响。40只雄性SD大鼠笼中饲养，适应1周后，大鼠随机分为正常饮食组和高脂饮食组，高脂饮食组大鼠给予15周高脂饮食建立肥胖模型。肥胖诱导成功后，大鼠随机分为正常对照组（WT）；WT+运动组（WTE）；肥胖对照组（OC）和肥胖+运动组（OE）。运动组大鼠进行跑台运动，每天40 min，每周5次，共8周。与WT组相比，OC组大鼠比目鱼肌毛细血管稀疏。WTE组毛细血管/肌纤维比率增加约40%，OE组比率与WT组无统计学差异。与其他三组相比，OC组骨骼肌VEGF，PI3K和eNOS水平降低。OE组这些蛋白水平与WT组相似。OC组MiRNA-126水平降低，PI3KR2水平升高。运动组（WTE和OE）MiRNA-126表达水平升高，PI3KR2表达水平降低。研究结果表明，肥胖导致大鼠骨骼肌毛细血管稀疏，这可能受MiRNA-126水平下降和PI3KR2增加的调节。运动恢复MiRNA-126水平和VEGF信号通路。

高脂饮食；大鼠；跑台运动；MiRNA-126；血运重建

人体肥胖的发病率持续增加，全球约13%的人群受其影响，肥胖是全球的一个主要公共健康问题[1-2]。肥胖导致骨骼肌有害的形态学改变，如毛细血管稀疏，常常发生于炎症和脂质异常引起的血管疾病[3-5]。另外，肥胖改变肌内脂肪含量，下调血管生成相关的几种蛋白质表达和营养作用[6-8]。在所有维持和调节新生毛细血管的MiRNAs中，MiRNA-126的主要作用是控制血管发生和血管完整性。MiRNA-126被认为是内皮特异性MiRNA[9]。MiRNA-126的作用是直接抑制VEGF通路中的两个负性调控子，参与血管发生信号的明确靶基因有：Sprouty相关蛋白1（Spred-1），一种Ras/MAPK通路的细胞内抑制剂和磷酸肌醇-3激酶调节亚基2（PI3KR2，抑或p85-β），负性调节PI3K（磷脂酰肌醇3-激酶）/Akt/eNOS通路的活性。

运动是一种治疗人体慢性病的非药物治疗策略。运动促进众多组织有益的形态学变化，如增加毛细血管密度、增加肌纤维直径和降低肌内脂肪含量[10-13]。然而，有关运动对肥胖骨骼肌毛细血管稀疏的分子机制的影响知之甚少。本研究目的是通过高脂饮食诱导的肥胖大鼠模型，探讨MiRNA-126表达情况以及运动对其表达的影响，以期探寻运动干预肥胖患者血管生成的可能机制。

1 方法

1.1 实验动物和处理

40只SD大鼠，4周龄，分笼饲养，自由饮食。室温保持在（22 ± 1.5）℃，相对湿度为50%~60%，12 h光照循环。适应环境1周后，大鼠随机分为正常组（6%脂肪，n = 20）和高脂饮食诱导肥胖组（45%脂肪，AIN-76A，n =20）。连续给予高脂饮食15周。

分别于第7和第15周测定大鼠体重和身长，根据Lee指数（Lee’s=(体重)1/3×103/体长(cm)）。结果见表1，与普通饮食组相比，高脂饮食组大鼠体重、体长和Lee指数均明显增高。

表1 高脂饮食组与普通饮食组大鼠体重及Lee指数的比较(±s)

1.2 运动方案

肥胖诱导成功后，大鼠随机分为正常对照组（WT，n = 10），正常+运动组（WTE，n = 10），肥胖对照组（OC，n = 10），肥胖+运动组（OE，n = 10）。运动组大鼠在跑台上运动，每天40 min，每周5次，共8周。16~20周，低强度运动，运动强度设置为5 m/min (5 min)、12 m/min (5 min)和18 m/min (30 min)，坡度为0%；21~23周，中等强度运动，运动强度设置为10 m/min (5 min)、16 m/min (5 min)和22 m/min (30 min)，坡度为0%[14]。在第23周，测量大鼠生理参数，包括心率、血压和VO2。这些参数组间没有显著差异。在最后一次运动后48 h（减少运动应激）处死大鼠。收集各组的组织样本，用于实验分析。

1.3 定量分析肌内脂肪

制备10 µm厚度的比目鱼肌连续切片。肌肉切片用3.7%甲醛固定，油红O工作液染色，产生红染脂质。计算机辅助形态测定系统测量红波长，分析完整细胞膜比目鱼肌肌内脂肪含量。每只小鼠取10个视野分析。

1.4 摄氧量测定

通过递增跑台中的呼出气体测定摄氧量（O2）。用氧和二氧化碳分析仪进行气体分析。用通过代谢仓的气体流量、吐出氧气分率和室内氧气分率计算O2。

1.5 骨骼肌氧化酶活性测定

参照先前的方法[15]，通过测量肌肉匀浆中柠檬酸合酶的活性评价运动效应。柠檬酸合酶活性依据总蛋白含量进行标化，用µmol/mg蛋白/min表示。

1.6 毛细血管分析

最后一次运动后24 h，处死不运动组和运动组小鼠，分离比目鱼肌后立即置于融化的异戊烷中，接着储存于液氮中。用低温恒温器将冷冻的骨骼肌从近端到远端切成10 μm后的横截面切片，用改良碱性磷酸酶反应染色毛细血管[16]。用Spot RT相机在20倍放大率下捕获数字图像，用Scion影像软件进行分析，测定每个视野下毛细血管数量和每个视野下肌纤维数量。整个肌肉切片的毛细血管总数除以肌纤维数量得出毛细血管/肌纤维比率。

1.7 MiRNA提取

全血样本收集于含乙二胺四乙酸的采血管中，用Norgen Blood RNA试剂盒提取总RNA包括miRNA。用分光光度计测量RNA浓度和质量。

1.8 逆转录-qPCR（RT-qPCR）

用TaqMan® MicroRNA 逆转录试剂盒和应用生物系统实时PCR检测系统进行RT-qPCR分析[17]。小核RNU6B用于标化。PCR引物序列如下：成熟has- MiRNA-126（靶基因）：UCGUACCGUGAGUA AUAAUGC，RNU6B（参考基因）：CGCAAGGATGA CACGCAAA-TTCGTGAAGCGTTCCATATTTTT。用实时PCR系统进行qPCR，循环为95℃10 min，接着95℃ 15 s和 60℃ 60 s，共40个循环。所有反应在同一试验条件下进行2次。用序列检测软件对结果进行分析，用RNU6B对miR-126的表达进行标化，用2−ΔΔCt计算相对表达值。

1.9 免疫印迹

用蛋白质印迹分析比目鱼肌PI3KR2、PI3K、VEGF和eNOS蛋白水平。100 mg冷冻比目鱼肌在含有100 mM Tris-HCl，50 mM NaCl，1% Triton X-100和蛋白酶及磷酸酶抑制剂混合液（1:100）中匀浆。4℃，3,000 ×g离心10 min以去除组织碎片。样本加载并依据蛋白质分子量进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（6%~15%）。电泳后，蛋白质电转移到硝酸纤维膜上。等量样本(30 μg)，用丽春红S染色的blot膜监测和平均转移效率。接着blot膜室温下在阻断缓冲液（5%脱脂奶粉、10 mM Tris-HCl (pH 7.6)、150 mM NaCl和0.1% Tween 20）中孵化2 h，接着与兔抗-VEGF、抗-PI3K、抗-PI3KR2、抗-eNOS多克隆抗体和鼠抗-GAPDH单克隆抗体4℃孵化过夜。用过氧化物酶结合的二抗和增强化学发光剂检测结合的一抗。用Image J软件分析谱带。骨骼肌GAPDH表达水平用于标化结果，其表达为对照表达百分比。

1.10 统计分析

所有结果均表示为平均值±标准差。使用双因素ANOVA进行统计分析。设< 0.05具有统计学意义。当ANVOA显示显著变化时，用Duncan事后检验进行个体比较。皮尔逊相关系数用于分析参数间的相关性。

2 结果

2.1 跑台运动对最大摄氧量和柠檬酸合酶活性的影响

通过评价最大摄氧量（VO2max）和柠檬酸合酶活性确定跑台运动的效应。结果显示，OC组和OE组大鼠VO2max显著低于WT组（< 0.05），但是，OE组大鼠VO2max显著高于OC组（< 0.05），WTE组大鼠VO2max显著高于其他三组（< 0.05）（图1a）。柠檬酸合酶活性的评价结果显示，WT组与OC组没有差异，但是与WT组和OC组相比，OE组和WTE组柠檬酸合酶活性显著增加（< 0.05）（图1b）。

图1（a）最大摄氧量和（b）柠檬酸合酶活性

数据表达为平均值±标准差，∗< 0.05

2.2 运动对身体成分的影响

与先前的研究结果一致[8]，OC组大鼠体重和内脏脂肪显著升高。结果显示，与其他三组相比，OC组的肌内脂肪含量较高。运动诱导OE组大鼠肌内脂肪降低，接近WT组，说明运动使得由于肥胖导致的肌内脂肪含量的升高趋于正常化（图2）。

图2 肌内脂肪百分比

数据表达为平均值±标准差，∗< 0.05

2.3 运动对骨骼肌的血管生成和VEGF蛋白质表达

结果显示，OC组大鼠出现严重的毛细血管稀疏，与WT组相比，毛细血管数量降低约40%。运动增加OE组大鼠毛细血管数量，接近WT组水平，说明运动可能增加血管生成。与WT组相比，WTE组毛细血管数量增加约40%（图3a）。

图3（a）毛细血管/肌纤维比率；（b）VEGF蛋白水平；（c）毛细血管密度

数据表达为平均值±标准差，∗< 0.05

VEGF是一个有效的血管生成因子。与WT组相比，OC组大鼠VEGF蛋白质表达降低。运动后，OE组大鼠VEGF蛋白质表达水平接近WT组，说明运动能够减缓VEGF蛋白表达的降低，运动是血管生成的一个调节因子，但与WT组相比，WTE组大鼠VEGF蛋白表达水平没有差异（图3b）。

2.4 运动对miRNA-126表达的影响

结果表明，与其他三组相比，OC组大鼠MiRNA-126表达降低。OE组大鼠MiRNA-126表达增加，比较接近WT组，说明运动可以恢复MiRNA-126的表达。WTE组miR-126表达增加。研究数据表明，MiRNA-126的表达与毛细血管/肌纤维比率间有关，MiRNA-126表达增加伴随毛细血管数量而增加（图4）。

图4（a）RT-PCR的miRNA-126表达水平，（b）miRNA-126表达水平与毛细血管/肌纤维比率正相关

数据表达为平均值±标准差，∗< 0.05

2.5 跑台运动对PI3KR2和PI3K/eNOS通路的影响

PI3KR2是MiRNA-126的一个靶基因。与WT组相比，OC组大鼠PI3KR2表达增加。运动后OE组大鼠PI3KR2表达接近WT组水平。说明大鼠运动能够减缓PI3KR2表达的降低。但是WTE组与WT组大鼠PI3KR2表达没有差异（图5a）。

与WT组相比，OC组PI3K蛋白表达降低。运动后OE组大鼠PI3K水平接近WT组。数据表明肥胖导致PI3KR2增加和PI3K蛋白表达降低，但运动减缓了PI3KR2表达的增加和增加PI3K的表达（图5b）。

研究结果表明，与WT组相比，OC组eNOS蛋白表达显著降低，OE组eNOS蛋白表达水平接近WT组，说明运动能够减缓肥胖所导致的eNOS蛋白表达降低。此外，WTE组eNOS蛋白表达也高于WT组（图5c）。

图5（a）PI3KR2蛋白水平；（b）PI3K表达水平；（c）eNOS蛋白表达水平；（d）PI3KR2、PI3K和 eNOS相对印迹

数据表达为平均值±标准差，∗< 0.05

3 讨论

MicroRNAs是内源性小非编码RNAs，由21~25个核苷酸构成，能够与蛋白质编码基因的mRNA 3’端非翻译区结合而调节其表达[18]。MiRNAs在细胞增殖、凋亡和分化中起重要作用[19]。MiRNA-126变异小鼠的血管异常与血管生长因子（VEGF和成纤维细胞生长因子）信号减少的结果相似[20]，MiRNA -126介导血液动力学和与血管发生有关的VEGF信号整合[21]。结果显示MiRNA在血管生成过程中的重要性。研究结果表明，跑台运动诱导比目鱼肌MiRNA-126表达增加，MiRNA-126表达增加与毛细血管/肌纤维比率增加正相关，运动诱导的血管发生与增加MiRNA-126表达有关[20]。

MiRNA-126的一个有效靶点是PI3KR2[20]，对VEGF信号通路中PI3K负性调节。生长因子刺激的PI3K活化可以通过测量ERK1/2、Akt、eNOS磷酸化状态进行评价；ERK1/2、Akt、eNOS是血管生成通路中的三个基本下游元件，即诱导血管舒张、增殖、生存和毛细血管形成。

研究数据表明，OC组大鼠MiRNA-126表达降低，这可能是导致其毛细血管稀疏的原因。运动导致血液重新分配，增加血管壁的剪切力，引起血管系统的microRNAs不同程度的表达[22]。研究显示，运动可恢复糖尿病患者MiRNA-126的表达[23]；研究结果也显示，运动影响肥胖大鼠骨骼肌毛细血管生成。

PI3KR2是MiRNA-126的一个有效靶点，它是调节血管发生的重要因素。PI3KR2通过抑制PI3K表达，直接负性调节VEGF；VEGF诱导PI3K磷酸化，产生磷酸化级联反应而活化Akt，在诱导eNOS信号中起重要作用，是血管生长和存活的基本过程[23]。PI3KR2通过抑制磷酸化级联反应而抑制PI3K，从而导致血管发生受抑[24]。

有关研究数据显示，OC组大鼠miRNA-126表达降低，导致其靶基因PI3KR2蛋白表达增加。跑台运动恢复miRNA-126表达，同时使PI3KR2蛋白表达正常。OC组大鼠出现严重毛细血管稀疏，导致大鼠的组织缺氧，甚至导致微血管坏死[25]。研究表明[26]运动增加微血管网络、直径和血管顺应性，增加运动可能是血管疾病的一个有效治疗策略。

与血管发生有关的调节蛋白包括VEGF和eNOS。研究表明[27]，运动通过增加机械收缩和血管剪切力，可以上调这些蛋白的表达。

VEGF和eNOS与内皮细胞增殖、迁移、分化和心血管形成有关。eNOS表达增加导致一氧化氮（NO）表达增加。这两个因素对血管舒张至关重要，因而维持血管的结构、功能和完整性。VEGF通过促进心血管形成调节血管发生，也是防止毛细血管丧失的抗凋亡因子。PI3KR2、PI3K和Akt可以调节VEGF和eNOS的功能，运动具有调节这些蛋白质的功能。

研究表明，肥胖后的大鼠MiRNA-126表达水平降低，进而导致血管发生信号通路蛋白质表达变化，引起毛细血管稀疏，而运动能够减缓大鼠的MiRNA-126的降低，恢复毛细血管密度。

4　小结

总之，MiRNA-126通过靶向PI3KR2的表达，在调节血管发生通路中起重要作用。肥胖导致大鼠的MiRNA-126表达降低，因而妨碍多种血管发生蛋白的表达。运动能够改善肥胖患者MiRNA-126的表达，从而恢复血管发生的信号蛋白的表达。

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EFFECTS OF TREADMILL EXERCISE ON IMPROVING REVASCULARIZATION INDUCED BY HIGH FAT DIET IN OBESE RATS THROUGH INCREASING MicroRNA-126

LI Jing

(College of Physical Education, Chaohu University, Hefei, Anhui 238000, China)

: To investigate the effects of exercise training on miR-126 expression and skeletal muscle revascularization in SD rats induced by high fat diet.: Forty male SD rats were housed in cages, one week later, rats were randomly divided into two groups: a normal diet group (12 % fat; n = 20), and a high fat diet group (40 % fat; AIN-76A; n = 20) induced for obesity by high fat diet for 15 weeks. The induced obesity rats were randomly subdivided into the normal control (WT); WT + exercise(WTE); obesity control (OC) and obesity control + exercise (OE) groups (10 rats per group). Rats in the exercise training groups were put on a treadmill for 40 min once a day, 5 times a week for 8 weeks.: Compared with the WT group, the OC group displayed capillary rarefaction. While exercise increased the capillary/fiber ratio by 40 % in the WTE group and capillary rarefaction in the OE group similar to group WT. Compared with the other three groups, VEGF, PI3K, and eNOS levels were reduced in the skeletal muscle of the OC group. Those levels in OE were similar to group WT. MiRNA-126 decreased and PI3KR2 increased in OC group, however, it is reverse about MiRNA-126 levels and expression of PI3KR2 in WTE and OE group.: The findings show that skeletal muscle capillary rarefaction in obesity, which is regulated by decreased MiRNA-126 levels and increased PI3KR2 expression. Exercise can recover MiRNA-126 levels and VEGF signaling.

high fat diet; rat; treadmill exercise; MicroRNA-126; revascularization

1674-8085(2018)01-0095-07

G804.2

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2018.01.020

2017-07-09；

2017-10-12

李靖(1982-)，男，安徽巢湖人，讲师，硕士，主要从事运动与慢性病防治研究(E-mail:23401777@qq.com).