斑马鱼GAPDH蛋白片段的原核表达差异分析

廖思宁，李 松，褚开淼，曾 菲，张 彪，胡有生



斑马鱼GAPDH蛋白片段的原核表达差异分析

廖思宁，李 松，褚开淼，曾 菲，张 彪，*胡有生

（井冈山大学医学部基础医学与药学院,，江西，吉安343009;）

为了分析斑马鱼基因不同区域原核表达构建的诱导效应差异，应用生物信息技术分析斑马鱼分子结构，通过定向删除技术，构建表达部分斑马鱼GAPDH蛋白片段的质粒。通过IPTG诱导，SDS-PAG检测，分析基因不同区域构建的蛋白表达差异。结果：引物对ZGCKF/ZGCXR构建的GAPDH重组表达质粒具有IPTG诱导表达效应，而引物对ZGNKF/ZGNXR构建的质粒则不具有IPTG诱导表达效应。因此，为了在原核表达真核蛋白时应考虑过表达的真核蛋白是否会影响宿主的代谢以及是否会导致宿主的抵抗，设计引物时应当选择合适的区域构建重组质粒才能获表达产物。

斑马鱼；GAPDH；蛋白片段原核表达；表达差异分析

甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH，EC1.2.1.12)是糖代谢中有氧氧化和无氧酵解途径中必需的一种重要催化酶。GAPDH在生物体各种组织中表达相对恒定并且表达水平较高，常常被用作研究其它基因和蛋白表达的内参[1- 4]。随着代谢组学研究的深入，发现GAPDH还表现出功能的多样性，它不仅参与能量代谢，还参与体内多种生理功能的调控。例如在细胞质中，GAPDH有磷酸激酶活性、参与催化微管的聚合及细胞保护；在生物膜上，GAPDH可促进膜融合并参与膜转运等[1, 5-6]。

文献表明，基因被利用于许多研究中。一方面GAPDH作为内参，通过RT-PCR和WB检测其它基因的转录表达水平和蛋白表达水平，对基因功能和基因表达调控研究起重要作用。例如Wu Y等（2012）和Chauhan AS等（2017）根据基因序列设计定量PCR引物，然后应用RT-PCR检测比较其它基因的转录表达水平和转录表达调节控制机制[5-6]。另一方面，有研究者根据斑马鱼基因序列，设计构建并原核表达GAPDH蛋白全长或部分片段，以原核表达的蛋白作为抗原物质，免疫大白兔或小鼠、山羊等动物，制备兔或鼠、羊抗斑马鱼GAPDH蛋白的多克隆抗体，这种单克隆抗体可作为内参基因，广泛应用于检测比较斑马鱼的其它蛋白表达水平，并广泛应用于生物医学重要的模式动物斑马鱼的分子生物学研究[1, 5-6]。

本研究通过分析斑马鱼基因序列，构建原核表达斑马鱼GAPDH蛋白部分片段，以用于斑马鱼GAPDH多克隆抗体的制备。但由于基因生物进化的高度保守性，而宿主菌对GAPDH蛋白全长或重要功能区域的表达往往具有抵抗性，因而不能有效地通过大量表达来满足多克隆抗体制备过程中对大量蛋白抗原的需要[7-9]。因此，本研究通过克隆斑马鱼基因，然后应用生物信息学分析GAPDH蛋白的分子结构，选择既能有效地大量表达，又能较好地纯化的GAPDH蛋白的片段来构建原核表达载体；通过大量原核表达并纯化GAPDH蛋白，为制备兔抗斑马鱼GAPDH多克隆抗体做准备。

1　材料与方法

1.1　材料和试剂

斑马鱼购于中国科学院水生生物研究所斑马鱼资源中心；大肠杆菌（）DH5α购自上海超研生物科技有限公司；BL21购自北京博凌科为生物科技有限公司；质粒pET32a购自上海君瑞生物技术有限公司。高保真DNA聚合酶PrimeSTAR、T4DNA连接酶、限制性内切酶Ⅰ和Ⅰ、dNTP、DL2000 Marker、RNA提取试剂盒和反转录试剂盒均购自TaKaRa公司；180 kDa蛋白质Marker购自Solarbio公司；PEG20000购自Biotopped公司；SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒、SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒及其它生化试剂和药品均购自生工生物工程有限公司; Ni-NTA His·BindTMResin购于德国Merk Novagen公司。

1.2　主要仪器设备

美国ABI公司PCR仪；美国Thermo公司高速离心机；德国sigma公司高速冷冻离心机；美国Bio-Rad公司垂直电泳；杭州奥盛三联多用途金属浴；北京博医康双门层析冷柜（YC-2）；上海智诚生化培养箱（ZXSD-R1430）、恒温培养振荡器（ZWYR-240）等。

1.3　实验方法

1.3.1生物信息学分析与引物设计

在NCBI基因信息库检索斑马鱼基因及其蛋白氨基酸序列（Danio rerio glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, mRNA, complete cds，NCBI Reference Sequence: NP_001108586.1），利用在线软件分析基因编码蛋白的cDNA序列及其ORF，同时对其编码的GAPDH蛋白的氨基酸序列进行结构域预测分析[17]。根据分析结果选择特定区域进行PCR引物设计。

1.3.2斑马鱼组织RNA提取和cDNA反转录合成

将喂养约1周的斑马鱼用于RNA提取；RNA提取后利用胶琼脂糖凝胶电泳检测所提取RNA质量；同时进行cDNA反转录，反转录体系参照TaKaRa反转录试剂盒说明书；反转录后以斑马鱼内参基因β-actin的定量引物通过PCR检测反转录cDNA的质量。

1.3.3斑马鱼GAPDH基因片段的扩增

用保守的PrimeSTAR DNA聚合酶对检测合格的cDNA进行PCR扩增。反应体系为：灭菌去离子水21 μL，10 nmol/L的上下游引物各1 μL，模板cDNA 2 μL，PrimeSTAR预混液25 μL，总体积50 μL；反应程序为：98 ℃ 10 min，然后98 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共38个循环，再72 ℃ 7 min 然后至4 ℃结束。用10 μLPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，以检测PCR的扩增效果。

1.3.4原核表达GAPDH片段的pET32a质粒构建

PCR扩增基因片段并纯化；用限制性内切酶I和I对纯化产物和pET32a质粒同时在37 ℃进行快速酶切15 min；酶切产物进一步进行DNA的纯化；纯化的DNA和质粒用T4DNA连接酶进行重组连接，4 ℃酶连24 h。

用酶连产物转化感受态大肠杆菌DH5α及阳性克隆筛选参照文献[10]；检测阳性菌扩菌送测序，进一步证实克隆菌是否重组了目的基因的片段，并通过测序结果分析排除突变。

1.3.5测序分析正确的克隆菌质粒提取与质粒转化大肠杆菌BL21

通过对测序结果的分析，选择构建正确无突变的菌进行扩菌，并提取质粒；用提取的质粒转化感受态的大肠杆菌BL21，并对阳性菌进行筛选鉴定[10]。验证阳性菌保存，用于后续实验。

1.3.6重组蛋白的小量诱导表达

带有重组有GAPDH基因片段的质粒的BL21菌，用小锥形瓶扩菌20 mL培养进行小量诱导表达[10]；通过诱导前后样品的SDS-PAG电泳检测诱导前后菌体蛋白表达的差异，根据构建的基因片段编码的蛋白大小判断目的蛋白的表达是否有诱导效应，诱导的蛋白大小与推测的大小是否一致。

1.3.7重组蛋白的大量表达和纯化

通过小量验证能被IPTG诱导且蛋白大小正确的构建菌，进行蛋白的大量表达[10]。

原核表达的带His-Tag的融合蛋白的分离纯化。购买于Novagen公司的His-Bind Resin用1 mL加液器轻轻吹匀，装入层析柱，沉积后体积约为2 mL。蛋白纯化程序参照His-Tag融合蛋白纯化的常规方法[10]。收集纯化的蛋白液用透析袋透析过夜。12 h后用PEG20000对透析蛋白液进行浓缩，直到浓缩到1 mL左右，收集浓缩蛋白置-20 ℃保存备用。

1.3.8 原核表达蛋白的SDS-PAG电泳

将大量表达过程收集的诱导前，诱导后，包涵体，纯化前，纯化后，浓缩后等蛋白样品加入蛋白loading buffer，混匀，100 ℃加热5 min，然后进行SDS-PAG电泳，检测大量表达过程的诱导效果，纯化效果和浓缩效果。

2　结果与分析

2.1 斑马鱼GAPDH蛋白结构分析

在NCBI基因数据库中检索到斑马鱼基因的完整cDNA核苷酸序列及其编码氨基酸序列(NCBI Reference Sequence: NP_001108586.1)。将其氨基酸序列输入SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)进行结构域的预测[11]，结果显示（图1）蛋白多肽链N端2-150氨基酸序列具有一个高度保守的3-磷酸甘油醛脱氢酶结构域，而C端则为不规则的卷曲结构。因此，考虑分别在GAPDH多肽链N端和C端分别设计引物，部分表达蛋白多肽链的片段。然后选择表达和纯化效果好的构建作为大量表达的构建菌[12-14]。

设计引物的位置应在斑马鱼GAPDH的ORF范围内，并且要注意不能引起移码突变。另外，引物外侧还需要加上酶切位点和保护碱基[10,15- 16]。根据设计引物的位置，推算ZGCKF/ZGCXR引物对和ZGNKF/ZGNXR引物对扩增DNA片段长度和表达的蛋白分子量。结果如表2，N端蛋白片段分子量为35.1 kD，C端为43.1 kD。

表2　构建表达GAPDH蛋白片段的DNA长度和蛋白质分子量

注 * 蛋白分子量含18kD的融合蛋白。

2.2　GAPDH原核表达质粒的构建

2.2.1GAPDH基因片段的扩增

以斑马鱼组织cDNA作为模板，对斑马鱼基因片段进行扩增。扩增片段以琼脂糖凝胶电泳显示，C端片段小于750 bp，N端片段略小于500 bp，如图2所示。根据引物对设计时的预测，引物对ZGCKF/ZGCXR扩增的基因的DNA片段长度约为684 bp；ZGNKF/ZGNXR扩增的片段长度约为465 bp，从图2可以看出电泳检测的结果与预测的结果一致。

图中1为引物对ZGCKF/ZGCXR扩增的GAPDH蛋白C端所对应的DNA片段；2为引物对ZGNKF/ZGNXR扩增的GAPDH蛋白N端所对应的DNA片段；中间泳道为DNA分子量标准

2.2.2两对引物构建的质粒表达GAPDH蛋白片段的比较

两对引物PCR扩增产物纯化后，通过重组构建到pET32a质粒上。通过测序检测结果显示，两种引物扩增产物的构建都正确，无移码突变，无提前终止突变也无点突变。将这些正确构建好的质粒进一步转化表达型大肠杆菌BL21，IPTG小量诱导结果显示，ZGCKF/ZGCXR引物对扩增片段构建的质粒在BL21菌中具有IPTG诱导蛋白表达的效应，如图3中泳道1和泳道2；而ZGNKF/ZGNXR引物对扩增片段构建的质粒在BL21菌中则不具有IPTG诱导蛋白表达的效应，如图3中泳道4和泳道5。具有诱导效应的重组质粒菌进一步进行大量诱导表达，通过镍柱进行蛋白纯化，浓缩蛋白SDS-PAG电泳显示（图3中泳道3），其分子量大小与小量诱导后图3中泳道2所显示的诱导蛋白的大小一致，且其大小与引物设计时所预测的分子量大小43.1 kD一致。综合克隆构建的测序分析结果表明，ZGCKF/ZGCXR引物对扩增的基因片段构建的质粒所表达的蛋白，就是GAPDH蛋白中所对应的片段，其可以作为蛋白抗原用来制备GAPDH多克隆抗体。

1、2、3为ZGCKF/ZGCXR引物对扩增构建表达的GAPDH蛋白C端片段，1为未加入IPTG诱导，2为同样条件下加入IPTG诱导，3为大量表后达纯化浓缩的蛋白；4、5为ZGNKF/ZGNXR引物对扩增构建表达的GAPDH蛋白N端未加入和加入IPTG诱导；箭头所指为诱导和纯化蛋白（43.1kD）

3 讨论

本研究设计了两对引物构建质粒表达斑马鱼GAPDH蛋白的部分片段，为斑马鱼GAPDH多克隆抗体制备准备GAPDH蛋白抗原。实验证实，两对引物中只有一对引物构建的质粒具有IPTG诱导的蛋白表达效应，而另外一对引物则不具有蛋白表达的诱导效应，如图3所示。究其原因，其差异是两对引物设计分别位于斑马鱼GAPDH基因编码的GAPDH蛋白结构的不同区域，如图1所示。

大肠杆菌DE3GAPDH蛋白SMART在线结构预测，显示GAPDH的N端为3-磷酸甘油醛脱氢酶活性结构域，C端为无规则卷曲结构。标尺显示的是大肠杆菌DE3的GAPDH蛋白结构对应的氨基酸序列

通过比对SMART预测的斑马鱼和大肠杆菌GAPDH的分子结构，发现两者十分相似。它们的N端都是高度保守的催化活性中心的结构域，C端都是不规则的卷曲结构，如图1和图4。事实上，它们都能够结合所催化的底物3-磷酸甘油醛和辅助因子NAD+，并且催化底物产生同样的产物1,3-二磷酸甘油酸[1-3]。因为不管斑马鱼还是大肠杆菌，甚至人类都需要GAPDH分解葡萄糖来产生能量物质ATP。因此，基因是高度保守的管家基因[5-6]。

斑马鱼（Zebra Fish）GAPDH氨基酸序列和大肠杆菌DE3（E. Coli. DE3）GAPDH氨基酸序列来源于NCBI基因数据库，登录号分别为NP_001108586.1和AAN80643.1。使用序列比对软件ClustalX进行比对。“*”号表示两者一致的氨基酸

进一步应用CluxtalX软件对两者GAPDH的氨基酸序列进行比对，结果显示它们具有很大的相似性，如图5所示。对氨基酸序列比对结果进行统计分析证实，它们全长的氨基酸具有68.3%的一致性，如表3。

表3 斑马鱼与大肠杆菌DE3的GAPDH蛋白多肽链的氨基酸序列一致性比较

尽管斑马鱼和大肠杆菌在进化上具有较远的联系，它们在氨基酸序列和蛋白质分子结构上表现为高度的进化保守性。这可能和它们催化同样的底物产生同样的产物有关；或者说它们虽然在进化上距离很远，但功能十分相似或相同[5-6]。因此，在大肠杆菌中过表达的斑马鱼GAPDH，可能也具有类似大肠杆菌GAPDH的作用，从而可能导致大肠杆菌内糖代谢异常，从而影响大肠杆菌的生长甚至生存。因此，大肠杆菌可能通过一定的机制对影响其代谢和生长的过表达蛋白表现出抑制其表达的作用。因此，设计表达斑马鱼GAPDH的N端酶活性中心结构域这部分蛋白不具有诱导效应。但这种推测还需进一步的实验证实。

另外一个方面，引物对ZGCKF/ZGCXR构建表达斑马鱼GAPDH蛋白C端的蛋白片段，由于这一片段避开了GAPDH的活性中心，它在大肠杆菌中的过表达不会影响大肠杆菌的代谢，也不会威胁它的生长和生存，因此，它的表达具有IPTG的诱导效应[13-15]。尽管这一片段的氨基酸的一致性要略高于不能诱导的这一片段，如表3。

综上所述，对于真核蛋白的原核表达，特别是高度保守的管家基因的过表达，在策略上应当考虑真核蛋白是否会影响或干扰宿主的代谢，导致宿主的抵抗[5, 13-15]。因此，在设计部分表达时，应当尽量避开其活性部位。

[1] 陈莹,王远卓,杨娟娟,等. 家蚕GAPDH 内参蛋白多克隆抗体的制备及其检测[J]. 生物技术通报,2017, 33(7):138-144.

[2] 吴巨龙,王绚,吕刚,等. 细粒棘球绦虫GAPDH蛋白的生物信息学分析及其重组表达纯化和酶活性检测[J]. 中国人兽共患病学报, 2014, 30 (2):125-129.

[3] 石磊,胡长敏,彭清洁,等. 牛支原体 GAPDH 定点突变、原核表达及生物学特性初步分析[J]. 中国奶牛, 2012, 5:1-4.

[4] 李昂,徐红艳,石建峰,等. 牙龈卟啉单胞菌外膜蛋白3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达[J]. 华西口腔医学杂志, 2011,29(2):199-202.

[5] Wu Y, Wu M, He G,et al. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase: a universal internal control for Western blots in prokaryotic and eukaryotic cells[J]. Anal Biochem, 2012,423(1):15-22.

[6] Chauhan A S, Kumar M, Chaudhary S, et al. Moonlighting glycolytic protein glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase (GAPDH): an evolutionarily conserved plasminogen receptor on mammalian cells[J]. FASEB J, 2017, 31(6):2638-2648.

[7] Roldán-Tapia M, Anné J, Reyes AG, et al. Streptomyces as Overexpression System for Heterologous Production of an Antimicrobial Peptide[J]. Protein Pept Lett, 2017, 24(6):483-488.

[8] Sun J, Chen Y, Qin F, et al. Prokaryotic expression of chicken interferon-γ fusion protein and its effect on expression of poultry heat shock protein 70 under heat stress[J]. Anim Sci J, 2017, 88(6):882-892.

[9] Vassilevski A A, Kozlov S A, Grishin E V. Antimicrobial peptide precursor structures suggest effective production strategies[J]. Recent Pat Inflamm Allergy Drug Discov, 2008, 2(1):58-63.

[10] Hu Y S, Fan L H, Wu C X, et al. Identification and function analysis of the three dsRBMs in the N terminal dsRBD of grass carp (Ctenopharyngodon idella) PKR[J]. Fish Shellfish Immunol, 2016, 50:91-100.

[11] Letunic I, Doerks T, Bork P. SMART: recent updates, new developments and status in 2015[J]. Nucleic Acids Res, 2015, 43(Database issue):D257-60.

[12] 李晨,刘伟,汉建忠,等. 小鼠子宫珠蛋白结合蛋白的生物信息学分析及其多克隆抗体制备[J].生理学报,2013, 65(2): 217–223.

[13] 韩小东,贾天军,贾晓晖,等. 甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶2( MASP -2) 的CUB1、CUB2 片段多克隆抗体的制备及鉴定[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2015,31(5): 689-696.

[14] 高媛,杨金菊,柳晓兰,等. 兔抗人CXCR3-B分子N端多肽多克隆抗体的制备与初步应用[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2006, 22(2): 223-226.

[15] 马海涛,郭佳倩,夏静,等. 兔抗小鼠含SET 结构域(赖氨酸甲基转移酶) 8(Setd8) 多克隆抗体制备和应用[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2017, 33( 2): 246-251.

[16] 吕亚丰,杨建林,秦宇,等. 人抗酶抑制因子-1 的原核表达纯化及多克隆抗体的制备[J]. 生物技术通报, 2017, 33(3):193-198.

[17] 熊伟,张晓娟,孙美涛,等. 人线粒体转录终止因子2基因启动子区的生物信息学分析[J].井冈山大学学报:自然科学版, 2016,37(1):51-56.

VARIATION ANALYSIS OF PROKARYOTIC EXPRESSION OF THE PROTEIN FRAGMENTS FROM ZEBRA FISH GAPDH

LIAO Si-ning, LI Song, CHU Kai-miao, ZENG Fei, ZHANG Biao,*HU You-sheng

（School of Basic Medicine and Pharmacy, Medical College, Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343009, China）

To analyze the variation of induction effect of the prokaryotic expressed Zebra fish GAPDH protein fragments which were constructed by different primers, the molecular structure of Zebra fish GAPDH was analyzed by bioinformatics approaches, and the targeting deletion technique was applied to construct the recombinant plasmids for partially expressed GAPDH. Then the variation of protein expression by the recombinant plasmids were induced with IPTG and detected by SDS-PAGE. And the primers had the efficiency of IPTG induced expression to the recombinant plasmids constructed by ZGCKF/ZGCXR, but not for ZGNKF /ZGNXR. The results indicated that it should be considered if the eukaryotic proteins will affect the metabolism of the prokaryotic host when the eukaryotic proteins over-expressed in prokaryotic organism, and result in the resistance of the host bacteria. Hence, proper region of the protein should be considered to express efficiently when the primers were designed.

Zebra fish; GAPDH; prokaryotic expression of the protein fragment; analysis of the variation of expression

1674-8085(2018)01-0037-06

Q786

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2018.01.009

2017-11-17；

2017-12-11

国家自然科学基金项目(31560595)；井冈山大学第六批大学生创新创业训练计划项目(63)

廖思宁(1997-)，女，江西赣州人，井冈山大学医学部预防医学专业2015级本科生(E-mail:804358470@qq.com); 李 松(1995-)，男，江西抚州人，井冈山大学医学部预防医学专业2013级本科生(E-mail:1769401545@qq.com); 褚开淼(1997-)，女，湖南张家界人，井冈山大学医学部预防医学专业2015级本科生(E-mail:1505790694@qq.com); 曾 菲(1997-)，女，江西吉水人，井冈山大学医学部预防医学专业2015级本科生(E-mail:1031281322@qq.com); 张 彪(1997-)，男，江西泰和人，井冈山大学医学部预防医学专业2015级本科生(E-mail:2504511574@qq.com); *胡有生(1968-)，男，江西吉水人，副教授，博士，主要从事分子免疫学研究(E-mail:huyousheng68@163.com).