油用牡丹籽仁中茋类化合物超声波提取及其抑菌活性研究

申少斐，裴燕妮，张 丽，王德富，牛颜冰

（山西农业大学生命科学学院，山西太谷030801）

油用牡丹以其较高的品质、产出与含油率的特点为众人所知[1-2]，它是我们国家特有资源中新开发的优质木本油料植物[3-4]，同时也是芍药科芍药属多年生灌木，其中，牡丹籽油中不饱和脂肪酸含量超过90%，亚麻酸占42%，享有“液体黄金”的美誉[5-6]，在心脑血管疾病的预防、智力的强化以及血脂的减低等方面都具有一定的效用[3，7-8]。

茋类化合物是指涵盖了1，2－二苯乙烯骨架的单体及其组成的聚合物的统称。大量的研究结果表明，芍药科植物种子中所含有的丰富茋类成分，是一类重要的天然多酚类化合物[9]。近年来，因其在生物活性方面的突出特点而吸引了诸多探究者对其进行研究[10-13]。目前，研究发现，油用牡丹种子壳中含有多种茋类化合物，包括Suffruticosol A，Suffruticosol B等芍药科植物种子特有的一类化合物[14-15]。但现阶段，关于油用牡丹籽仁中茋类化合物的获取途径及其抑菌活性的研究鲜有报道。

为充分利用油用牡丹资源，本研究将原料选定为凤丹油用牡丹籽仁，借助响应面分析法对其茋类化合物的超声波提取方式加以改进，并通过大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌试验研究提取物的生物活性，旨在为油用牡丹资源的进一步开发利用提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试油用牡丹凤丹种子由山西汾河牡丹实业股份有限公司提供。

供试菌种为大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。

1.2 试验方法

1.2.1 油用牡丹籽仁粉末制备 将凤丹牡丹种子室内通风干燥、人工拣选、手工去壳，获得牡丹籽仁，并将其破碎成粉。用索氏提取脱脂[16]：即取适量的牡丹籽仁粉末于折叠好的定性滤纸中，将其包好放入索氏提取器的浸提罐，同时用量筒量取适量石油醚[17]，在80℃条件下水浴加热回流3次，将所得粉末置于干净纸上，室内避光通风12 h，压成细粉装入自封袋中备用。

1.2.2 标准曲线绘制方法 精准称没食子酸0.5 g，用适量的蒸馏水定容，使其保持在100 mL，用移液管从中依次量取 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，并分别稀释100倍。在2～3 min内，从上述稀释液中分别移取 0.1 mL，然后依次滴加 6 mL 的蒸馏水、0.5 mL 的Folin-Ciocalteu 试剂、1.5 mL 20%的碳酸钠溶液，振荡、摇匀，之后加水定容到10 mL。25℃避光反应30 min，记录749 nm处的吸光值[14]。将吸光值（A）、没食子酸浓度[18]分别设定为纵、横轴的取值[13]，绘出标准曲线。

1.2.3 茋类化合物的提取 准确称量若干份1.0 g牡丹籽仁粉末，用70%乙醇溶液作提取溶剂，在不同的液料比、时间和功率下进行超声提取。提取完之后离心5 min，上清液存放于棕色瓶中待测。

1.2.4 茋类化合物含量的测定 本试验采用Folin-Ciocalteu比色法[18-19]进行茋类化合物含量的测定。分别吸取放于棕色瓶中的上清液0.1 mL，并依次滴加6 mL的蒸馏水、0.5 mL的Folin-Ciocalteu试剂、1.5 mL 20%的碳酸钠溶液，振荡、摇匀，之后加水定容到10 mL。室温环境中完成避光反应，持续30 min[18]，测试749 nm处的吸光值[14]，同时借助回归方程计算茋类化合物的含量。

1.2.5 供试菌种的制备 在提早预备好的LB液体培养基当中加入干燥大肠杆菌（或者金黄色葡萄球菌）菌落，封口，将三角瓶置于37℃的摇床上振摇，待液体培养基浑浊后停止振摇（不可长期振摇，以防菌种死亡）。将接种环灭菌，蘸取菌液，在LB固体培养基上划线（每次划线前接种环都要用酒精灯火焰灼烧并冷却），接着封口，将其放进37℃培养箱中，0.5 h后将培养基倒置。用1 000 μL移液枪将液体培养基加入到EP管中（每个EP管2 mL液体培养基），一段时间后观察细菌生长情况，最终制成浓度为106～107个/mL的菌悬液，置于4℃环境中备用。

1.2.6 抑菌活性的测定 将分离出的茋类化合物用甲醇稀释，采用二倍稀释法，分别配制出质量浓度为 2.5，1.25，0.625，0.313，0.156 mg/mL 共 5 个梯度。然后用打孔工具在无菌滤纸片上打出若干滤纸小圆片，将这些小圆片分别浸泡在稀释好的药液以及蒸馏水（蒸馏水为空白对照）中。取LB固体培养基，以记号笔于培养皿底端对培养基进行均匀划分，使其成为6个不同的小区域，借助涂布棒把已经完成活化的大肠杆菌在固体培养基上加以涂抹分布，使其具有均等性，并把浸泡好的小圆片贴在每个区域中心。封口，放入37℃的培养箱中，0.5 h后倒置。一段时间后，待培养基上长出菌落后，测量抑菌直径并记录结果，以蒸馏水浸泡过的滤纸片作为空白对照组。采用以上方法完成金黄色葡萄球菌的相同试验，对抑菌直径加以测量，记录结果。

1.3 单因素试验

1.3.1 液料比试验 用电子天平称量1.0 g脱脂牡丹籽仁粉末若干份，室温下用70%乙醇溶液作为提取溶剂，超声时间40 min，超声功率200 W。分别在液料比为 10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1（mL/g）的状况下完成超声提取，而后进行5 min的离心，取上清液存于棕色瓶。最后分别取0.1 mL不同液料比提取液，用1.2.4茋类化合物合量的测定显色方法，经回归方程计算不同液料比茋类化合物的含量。1.3.2 超声提取时间试验 液料比与超声提取功率分别为 30∶1（mL/g），200 W，超声提取时间分别选取 20，30，40，50，60 min。后续处理同 1.3.1。

1.3.3 超声提取功率试验 液料比 30∶1（mL/g），超声时间40 min，超声功率分别选取100，150，200，250，300 W。后续处理同 1.3.1。

1.4 Box-Behnken 试验设计

参照单因素试验结果，液料比、超声时间、超声功率3个因素分别用A，B，C表示，每个因素设高、中、低水平，分别用 +1，0，-1 表示[20-21]。表 1 采用响应面试验方案随机进行试验，以减少误差，总计进行17组试验，每组试验进行3次，结果取平均值。

表1 响应面分析法三因素及水平

2 结果与分析

2.1 没食子酸标准曲线

由图1可知，没食子酸的标准曲线回归方程是y＝1.1657x＋0.00695（R2＝0.996）。式中，x 代表样品没食子酸的质量浓度（μg/mL），y为吸光度值（A）。结果表明，x在0～0.25 mg/L区间内线性关系较佳[15]。

2.2 单因素结果分析

2.2.1 液料比对茋类化合物提取效率的影响 由图2可知，在其他条件不变、改变液料比时，茋类化合物提取量在 0.216 1～0.465 0 mg/g，当液料比较低时，牡丹籽仁粉黏度较大，在提取溶剂中不易扩散，超声时的空化效应显著降低，使得牡丹籽仁中茋类化合物释放、扩散、溶解速率慢，提取量较低；当液料比增多时，提取溶液渗透压增大，有利于牡丹籽仁中茋类化合物的提取，液料比为30∶1（mL/g）时，提取量最大；之后再增大液料比，由于溶剂中茋类化合物达到平衡浓度，提取量不再升高，趋于稳定。因此，从提取剂使用量的经济性和茋类化合物提取效率方面考虑，最终选定30∶1（mL/g）作为最优液料比。

2.2.2 超声时间对茋类化合物提取效率的影响由图3可知，在其他条件不变、改变超声时间时，茋类化合物提取量在 0.425 2～0.442 9 mg/g。不同超声时间对牡丹籽仁中上述化合物溶出的效用表现为先促进后抑制，在20～40 min时，茋类化合物的提取量随提取时间的增加而持续加大。这是由于超声破碎效用愈强劲，细胞的受损度就愈高，牡丹籽仁中的茋类化合物更加易于溶解出来，提取量也越大，并在40 min达到峰值；之后超声提取时间高于40 min，提取液的温度则大幅上涨，以致低聚茋类化合物的构造出现改变，提取量则快速减小。因此，超声提取的最佳时间为40 min。

2.2.3 超声功率对茋类化合物提取效率的影响从图4可以看出，在其他条件不变、改变超声功率时，茋类化合物提取量在 0.328 1～0.499 1 mg/g。在提取过程中，随着超声功率的提高，超声波产生的纵横双向振动更加剧烈，超声的空化效应更加明显，直到200 W时，提取量达到最大；之后超声功率继续增大，提取液的温度会显著提高，导致茋类化合物结构变化，含量则降低。因此，选用200 W的超声功率为最佳功率。

2.3 响应面结果分析

经Design Expert 8.0对表2所得的方案数据进一步解析，将响应值Y视作茋类化合物的具体提取量，回归拟合模型，得出下式。

表2 响应面试验设计与分析

从表 3可以看出，模型的 F＝27.89和P＝0.000 1，达极显著水平（P＜0.01，其余同），与实际试验的拟合度高，试验精准度高，操作可信。失拟项P＝0.233 7＞0.05，不显著，表明无其余因素的突出干扰，模型是有效可行的，可将茋类化合物提取量与液料比、超声时间与超声功率之间的关联性较为清晰地展现出来。调整决定系数为0.938 0，表明93.80%的试验指标的变化能用此模型分析。模型的决定系数 R2＝0.972 9＞0.900 0，即该模型契合度很好，表明97.29%的试验数据可用这个方程解释。从回归系数显著性检验可以看出，A2，B2，C2和A项极显著，交互项AB显著，其余项均不显著。根据P值大小分析，单个因素对牡丹籽仁中茋类化合物提取量影响大小顺序为A（液料比）＞C（超声功率）＞B（超声时间）。

表3 方差分析结果

2.4 多因素间交互作用分析

2.4.1 液料比和超声时间的交互作用 图5表示当超声功率为200 W时，液料比、超声时间二者对茋类化合物提取量的交互作用。由图5可知，3D响应面较陡，表明A和B交互时茋类化合物提取所受影响较大；3D响应面图显示，伴随液料比的提高和时间增加的过程渐渐上移，且液料比的影响较超声时间更为显著。

2.4.2 液料比和超声功率交互作用 图6表示当超声时间为40 min时，超声功率、液料比二者对茋类化合物提取量的交互影响。由图6可知，当液料比为固定数值时，如果超声功率增加，则茋类化合物的提取量表现为先上涨而后减小；当超声功率为固定数值时，如果液料比增大，则茋类化合物的提取量也表现为先上涨而后减少的变化趋势。

2.4.3 超声时间和超声功率交互作用 图7表示当液料比为30∶1（mL/g）时，茋类化合物提取量受到超声功率及超声时间的交互影响。从图7可以看出，曲面较平坦，说明B和C互作对茋类化合物提取量的影响不显著，与方差分析的结果相对应（BC的 P＞0.05）。

2.5 验证试验

为了对响应面分析法设计的可操作性加以证实，借助优化改进后的提取条件对牡丹籽仁中低聚茋类化合物提取展开具体的试验，其中，液料比为33.68∶1（mL/g）、超声时间为 39.42 min、超声功率为200.18 W。根据实际条件，将参数对应优化为：34∶1（mL/g），40 min，200 W，该条件下，重复 3 次试验，取平均值，从而得到茋类化合物的提取量是0.465 4 mg/g，与理论预估数值较为一致。说明采用Box-Behnken的中心组合设计优化得到的回归方程能够较真实地反映各因素对牡丹籽仁中茋类化合物提取量的影响。因此，该模型应用于优化凤丹牡丹籽仁中茋类化合物的提取工艺是可行的。

2.6 不同质量浓度的牡丹籽仁茋类提取物对细菌的抑制作用

由表4可知，牡丹籽仁茋类提取物可以对细菌产生显著的抑制作用，当茋类提取物质量浓度为2.5 mg/mL，则对2类细菌的抑制成效最优；在低质量浓度为0～2.5 mg/mL，浓度愈高，则菌种被抑制的成效愈突出。若浓度一样，从抑菌圈直径来看，大肠杆菌较金黄色葡萄球菌大。所以，茋类提取物对大肠杆菌的抑菌成效远远超出金黄色葡萄球菌。

表4 不同质量浓度的牡丹籽仁茋类提取物对细菌的抑制 mm

3 结论

本研究通过超声提取牡丹籽仁中茋类化合物，并采用单因素试验和响应面分析法对分离条件进行优化。结果表明，牡丹籽仁中茋类化合物提取量受到各个因素的影响大小从高至低依次为液料比、超声功率、超声时间；最适工艺条件为：液料比34∶1（mL/g）、功率 200 W、时间 40 min，此时茋类化合物的提取量为0.465 4 mg/g。最后，借助对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径的观察，证实了牡丹籽仁茋类化合物的抑菌性较佳，且对大肠杆菌的抑菌成效尤为突出。

参考文献：

［1］李育材.中国油用牡丹工程的战略思考 [J].中国工程科学，2014，16（10）：58-63.

［2］王晗.油用牡丹栽植技术[J].河南农业，2017（6）：47-48.

［3］周琳，王雁.我国油用牡丹开发利用现状及产业化发展对策[J].世界林业研究，2014，27（1）：68-71.

［4］李春焕，王晓琴.芍药属油用植物种质资源及研究进展[J].中国粮油学报，2017，32（5）：138-146.

［5］毛善巧，李西俊.牡丹籽油的研究进展及油用牡丹综合利用价值分析[J].中国油脂，2017，42（5）：123-126.

［6］黄兴琳，陆俊杏，廖冰楠，等.油用牡丹脂肪酸脱氢酶基因FAD3的 克 隆 与 表 达 分 析 [J].中 国 农 业 科 学 ，2017，50（10）：1914-1921.

［7］王顺利，任秀霞，薛璟祺，等.牡丹籽油成分、功效及加工工艺的研究进展[J].中国粮油学报，2016，31（3）：139-146.

［8］张涛，高天姝，白瑞英，等.油用牡丹利用与研究进展[J].重庆师范大学学报，2015，32（2）：143-149.

［9］刘普，牛亚琪，邓瑞雪，等.紫斑牡丹籽饼粕低聚茋类成分研究[J].中国药学杂志，2014，49（12）:1018-1021.

［10］SHENT，WANGXN，LOUHX.Natural stilbenes:an overview[J].Natural Product Reports，2009，26：916-935.

［11］刘普，李小方，牛亚琪，等.油用牡丹籽饼粕低聚茋类化合物提取工艺及活性研究[J].中国粮油学报，2016，31（6）：79-85.

［12］ SARPIETRO M G，SPATAFORA C.Effect of resveratrol-related stilbenoids on biomembrane models[J].Journal of Natural Products，2013，76（8）：1424-1431.

［13］ Pawlus A D，Sahli R，Bisson J，et al.Stilbenoid profiles of canes from vitis and muscadinia species[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2013，61（3）：501-511.

［14］牛亚琪.油用牡丹籽榨油副产物低聚茋类和单萜苷类化合物提取与纯化研究[D].洛阳：河南科技大学，2015.

［15］刘普，许艺凡，李小方，等.油用牡丹籽壳低聚茋类化合物富集及对牡丹籽油抗氧化作用研究 [J].中国粮油学报，2017，32（6）：84-90.

［16］戚军超，周海梅，马锦琦，等.牡丹籽油化学成分GC-MS分析[J].粮食与油脂，2005（11）：23-24.

［17］庞雪风，何东平，胡传荣，等.牡丹籽油的提取及蛋白制备工艺的研究[J].食品工业，2013（8）：73-76.

［18］李文仙，俞丹，林玲，等.Folin-Ciocalteu比色法应用于蔬菜和水果总多酚含量测定的研究 [J].营养学报，2011，33（3）：302-307.

［19］史淑红，郝建平，王秋宝，等.响应面法优化山茱萸叶叶绿素的超声提取工艺[J].山西农业科学，2016，44（3）：310-314.

［20］樊晓艳.苹果渣中多酚提取条件的优化 [J].山西农业科学，2016，44（9）：1356-1359.

［21］邹立飞，邹雨坤，李光义，等.响应面法优化甜瓜枯萎病拮抗菌F1发酵条件[J].华北农学报，2015，30（Z1）：303-308.