萱草多倍体诱导及其鉴定

武 江，李 丽，曹冬梅，左力翔，王云山

（山西省农业科学院园艺研究所，山西太原030031）

萱草（Hemerocallis fulva）为百合科萱草属多年生宿根草本地被植物，其植株低矮，株型挺拔，花色艳丽，花期长，抗性强，适栽范围广，观赏和绿化价值高[1-3]。萱草属植物根据基因型不同，分为二倍体、三倍体和四倍体。多倍体萱草因具有植株强壮、生长势强、花茎粗、花大、花型多、颜色变异丰富等特点，在园林绿化、景观营造中应用前景广泛，也使育种者越来越关注萱草的多倍体育种。

多倍体植物具有营养器官巨大、活性成分含量高、抗逆性强等显著特征[4-5]，与多倍体萱草育种目标的设定一致。多倍体育种是植物品种改良的重要手段，而组织培养则是植物品种保存和种性纯化、扩大栽培的有效途径[6]。化学诱变是植物多倍体诱导普遍采用的方法，而秋水仙素作为一种被广泛采用且具有显著效果的多倍体诱导药剂，其对植物材料染色体结构影响甚微，很少发生遗传上的不利变异[7]。由于诱变剂诱导多倍体的不稳定性、诱变率较低及鉴定方法的复杂性等，萱草多倍体育种进展缓慢，有关萱草的多倍体育种鲜见报道。

本研究借助浸泡法和混培法2种诱变方法筛选适宜获得萱草多倍体的秋水仙素浓度和愈伤组织培养时间，利用流式细胞仪检测细胞核DNA含量，并结合传统的倍性鉴定方法对检测结果进行验证，以期建立高效的萱草多倍体诱导体系，为萱草多倍体新品种选育提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为萱草二倍体杂交品种10-154（Hemerocallis fulva 10-154），通过组织培养获得的愈伤组织由山西省农业科学院园艺研究所花卉研究中心提供。该二倍体愈伤组织生长健壮、组织紧密且带绿色芽点。用刀片将其切成长、宽、高均为0.5 cm的立方体，备用。

1.2 试验方法

通过秋水仙素浸泡法和混培法进行适宜浓度和培养时间筛选，每处理选取愈伤组织20块，3次重复，共计60块。通过比较存活率、形态变异率、诱变率和增殖系数，获得最佳的处理组合。

1.2.1 浸泡法 用灭菌蒸馏水配制质量浓度分别为 0 （对照），0.01% ，0.03% ，0.05% ，0.10% ，0.20% ，0.30%的秋水仙素无菌溶液，过滤，灭菌，然后将愈伤组织小块置于溶液中，保持小块始终处于液面之下。将液体置于转速为80～100r/min的摇床上，分别培养8，16，24 h。培养完成后，立即将愈伤组织小块取出，以灭菌蒸馏水冲洗4次，每次冲洗持续5 min，之后用无菌吸水纸吸干表面水分，将小块转接到MS＋6-BA 0.1 mg/L＋KT0.1 mg/L＋NAA 0.05 mg/L分化培养基上，置于组织培养室培养。

1.2.2 混培法 用灭菌蒸馏水配制秋水仙素溶液，加至未凝固的分化培养基中配制成质量浓度分别为 0.001%，0.005%，0.020%，0.040%，0.080%的培养基，轻轻晃动使之分布均匀。待培养基凝固后接种愈伤组织。以添加相同体积灭菌蒸馏水的分化培养基为对照。将培养基置于组织培养室中分别培养5，10，15 h。分化培养基与浸泡法所用培养基成分相同。

1.2.3 指标统计与计算 组织培养室中愈伤组织的培养温度为（25±2）℃，光强为2 500 lx，光照时间为16 h/d，培养基pH值为5.8。试验进行25 d后，统计愈伤组织存活情况和不定芽增殖系数。然后将成活植株转入生根培养基1/2 MS＋NAA 0.5 mg/L中，15 d后统计形态变异率。在进行变异率统计时，以形态学变异和气孔显著性增大作为变异的初步鉴定指标。

存活率＝存活的外植体数/接种的外植体数×100%；增殖系数＝不定芽新增的株数/存活的不定芽数；形态变异率＝出现形态变化的外植体数/接种外植体数×100%；诱导率＝染色体发生变异的植株/（存活不定芽数+增殖不定芽数）×100%。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 DNA相对含量测定 用BDFACSCalibur流式细胞仪，采用Otto提取液对待测材料的根尖细胞进行DNA相对含量测定[8-9]。

1.3.2 根尖染色体数观察 切取再生植株的幼嫩根尖，用对二氯苯预溶液处理4.5 h，之后在4℃条件下用卡诺固定液固定24 h，在水浴锅的环境下用l mol/L盐酸解离10 min，解离完毕后用卡宝品红染色液染色。每再生植株统计20个以上细胞，以超过85%的细胞具有恒定、一致的染色体数作为该植株的染色体数目。用Olympus-IX71倒置显微镜在100倍目镜下观察，选取染色体分散均匀的细胞拍照[10]。

1.3.3 气孔密度和保卫细胞大小测定 取待测植株，将叶片小心取下，采用张秀芳等[11]的印迹法进行气孔鉴定。用蒸馏水清洗下表面，在该表面中部1 cm×3 cm的面积上均匀涂抹无色指甲油，干燥后将指甲油膜取下。将其与叶片接触的一面向下，置于载玻片上并盖好盖玻片。在20×16倍镜下随机观察10个视野，统计气孔密度；在40×16倍镜下测量保卫细胞大小。所有材料均选取相同叶位的叶片，3次重复。

1.3.4 叶片大小测定 选取再生植株叶片，用游标卡尺测量长度和宽度，并计算叶形指数（叶形指数＝长度/宽度）。所有叶片均取自不同倍性植株相同叶位。

1.4 数据分析

采用SPSS 22.0进行数据统计分析，所有数据均经邓肯式新复极差测验。

2 结果与分析

2.1 秋水仙素处理萱草的最佳方法筛选

2.1.1 浸泡法对萱草愈伤组织诱导的影响 由表1可知，同一培养时间下，所有秋水仙素质量浓度处理的愈伤组织存活率均显著低于对照；在同一处理质量浓度下，愈伤组织存活率均随处理时间的延长而显著降低。就芽增值系数而言，不同质量浓度处理的系数均显著低于相同条件下对照的数值；而同一秋水仙素浓度下，处理8 h的愈伤组织不定芽增殖系数均处于较高水平，表明用秋水仙素浸泡萱草进行多倍体诱导，并非培养时间越长越好。不同处理组合的愈伤组织的形态变异率比较，培养8 h以0.10%秋水仙素处理的最高（P＜0.05），为 52.22%；在16，24 h时具有最高形态变异率的秋水仙素处理质量浓度则分别为0.20%和0.03%，但这2个处理的值均较0.10%秋水仙素处理下培养8 h的处理低。在诱导率方面，0.30%秋水仙素处理的愈伤组织均未发现染色体发生变异的植株；在8，16，24 h培养时间下诱导率最高的秋水仙素质量浓度分别为 0.10%，0.05%，0.05%，以秋水仙素质量浓度为0.10%、培养时间为 8 h的处理诱导率最高（35.56%）。秋水仙素质量浓度过高或过低均使诱导率降低。综合上述比较结果发现，用0.10%的秋水仙素浸泡萱草愈伤组织，在培养8 h时愈伤组织形态变异率、多倍体诱导率均最高，且具有相对较高的存活率和芽增殖系数，该组合最好。

表1 秋水仙素浸泡对萱草愈伤组织形成的影响

2.1.2 混培法对萱草愈伤组织诱导的影响 混培 法对萱草愈伤组织诱导的影响结果列于表2。

表2 秋水仙素混培对萱草愈伤组织形成的影响

从表 2 可以看出，质量浓度为 0.001%，0.005%，0.020%秋水仙素处理的萱草愈伤组织存活率随培养时间的延长均呈显著降低趋势（P＜0.05），0.040%质量浓度下为10 h存活率最高；各处理在同一培养时间、不同质量浓度下的存活率均显著低于同期对照，有8个组合的存活率均保持在25%以上。质量浓度为0.080%的秋水仙素处理萱草愈伤组织，不定芽增殖系数为0，说明该质量浓度对不定芽的形成不利；培养5 h时，以0.040%浓度的处理增殖系数最高（P＜0.05），其他培养时间下以对照的增殖系数最高。就形态变异率而言，秋水仙素质量浓度为 0.040%培养 10，15 h，0.080%及对照的形态变异率均为0；其他质量浓度下，形态变异率均随培养时间的延长而升高；同一培养时间、不同浓度秋水仙素处理比较，形态变异率均以0.020%质量浓度下最高（P＜0.05），其次是 0.005%的处理。诱导率是评价愈伤组织诱导成功率的关键指标之一。由表2可知，浓度为0.005%的秋水仙素培养15 h具有最高的多倍体诱导率，其他处理均显著低于该处理。综合比较，认为以0.005%的秋水仙素混培，在培养15 h时愈伤组织具有最高的多倍体诱导率和较高的存活率、芽增殖系数和形态变异率，是混培法下萱草愈伤组织诱导的最佳组合。

2.2 细胞DNA相对含量比较

以2.1中得到的最佳愈伤组织组合诱导萱草多倍体植株，经形态学鉴定，筛选出变异株，进行流式细胞仪分析、检测倍性，结果发现，所得诱变株中既有二倍体，又有四倍体和混倍体。图1-A为已知倍性的二倍体，在荧光强度45处出现峰值；在图1-B中，荧光强度90处出现尖峰，说明经秋水仙素诱导后植株的DNA相对含量是二倍体的2倍，该变异株为四倍体。

2.3 根尖染色体数比较

根尖染色体鉴定结果表明，二倍体萱草植株的细胞染色体数目为2n＝2x＝22（图2-A）；对流式细胞仪鉴定出的四倍体植株的根尖染色体进行鉴定，发现其数目为2n＝4x＝44（图2-B），是二倍体染色体数目的2倍，进一步确定该变异株为四倍体。染色体倍性鉴定结果与流式细胞仪鉴定结果一致。

2.4 气孔性状比较

由表3可知，四倍体植株叶片下表皮保卫细胞的长度、宽度均显著高于二倍体植株，分别为二倍体植株的2.06倍和2.02倍。此外，单个视野气孔个数以二倍体最多（P＜0.05），反映了其较高的气孔密度，也说明四倍体植株叶片的气孔较大。

表3 二倍体与四倍体植株气孔特征比较

2.5 形态学比较

由表4可知，四倍体植株叶片的长度和叶形指数显著低于二倍体；而宽度则相反。对萱草二倍体及经多倍体诱导得到的四倍体植株进行形态观察，发现四倍体较二倍体植株矮小，茎基部较粗壮，叶片较宽，叶边呈不规则卷曲、褶皱，生长较缓慢。试验数据与实际观察相吻合。

表4 二倍体与四倍体植株叶片特征比较

3 讨论与结论

人工诱导多倍体是创建植物新种质或新类型的一个重要途径，也是植物育种的一个重要手段[12]。通过植物离体组织诱导同源四倍体已成为获得多倍体的有效途径[13]。不同植物材料所用的秋水仙素浓度及处理时间不尽相同，确定特定植物、组织、器官的最佳秋水仙素处理浓度及时间，需要不断探索[14]。本研究利用秋水仙素浸泡法和混培法诱导愈伤组织小块，通过秋水仙素不同浓度和培养时间筛选，确定了萱草愈伤组织多倍体诱变的最佳处理，经不同方法鉴定评价，成功获得了萱草的同源四倍体新材料，为萱草遗传育种新途径开发和新方法运用奠定了基础。

将化学诱变与植物组织离体培养技术结合，对植物材料遗传变异的诱发、繁殖、改良、选择技术具有独特的优势和发展潜力。其不受环境条件限制，可节省时间，扩大变异谱，提高变异率[15-16]。有研究指出，秋水仙素虽在诱导植物多倍体育种中应用广泛，效果显著[17]，但它在使用过程中还可能存在副作用，即具有一定的毒害作用，常表现为对植株生长的抑制[18]。本试验中，虽然通过浸泡法和混培法筛选到了萱草愈伤组织最佳处理浓度和培养时间，其愈伤组织存活率在所有处理中并非最高，芽增殖系数也并非最高，但诱导率却最高，说明虽然所试验的浓度和培养时间对愈伤组织的毒害作用存在，但仍可作为萱草多倍体诱导的适宜处理。

多倍体植物一般表现为茎粗、叶宽厚、颜色深、花大、果大、种子大而少[19]，植株“巨大性”非常明显[20]。本研究中，四倍体与二倍体植株相比，具有较大宽度和较小的长度，叶片不规则，生长缓慢，与前人在其他植物上的研究结果类似[21-23]。

流式细胞仪测定法结合根尖染色体计数法是最可靠的多倍体鉴定方法。利用这2种方法结合进行叶片下表皮单位面积的气孔大小、密度等形态学鉴定，可从多个方面对多倍体的倍性进行确定[24-27]。本试验通过流式细胞仪进行萱草倍性鉴定，发现四倍体植株的DNA相对含量为二倍体的2倍，借助根尖染色体计数法鉴定多倍体倍性，所得结果也与流式细胞仪检测结果一致，染色体数为原二倍体的2倍。在得到四倍体萱草的同时，也进一步验证了流式细胞仪法检测植物倍性的可靠性。

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