PUF蛋白的研究进展

张 静，王文珍，蒲首丞，孙梅好

（浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华321000）

细胞能够精准地控制mRNA在恰当的时候在特定的位置产生定量的蛋白质，而RNA结合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs） 和小 RNA（miRNA）控制着这些进程。它们结合特定的mRNAs，从而控制mRNA的稳定性、翻译过程和定位[1]。一个RNA结合蛋白能够结合许多的RNA，从而建造一个庞大的RNA网络来调控特定的生物学功能。蛋白质结合RNA有多种多样的方法，并且通常都难以预料是以怎样的方式结合。目前，存在一些与RNA作用并对其产生影响的工具的使用，类似于短干扰RNA和小分子RNA的使用，但这些工具的使用会降低目标RNA的多样性和在细胞中的表达量[2]。因此，能够被设计的工程性RNA结合蛋白是十分具有吸引力的，因为它们能与任何想要的效应结构域相结合，能够选择性结合一种特定的RNA目标，从而来研究或者控制某一方面的新陈代谢作用。最早在果蝇D.melanogaster中和线虫C.elegans中分别发现的PUMILIO和FBF，并以此来命名的PUF蛋白就是这样一类蛋白质[3-4]。PUF蛋白普遍存在于真核生物中，从酵母、果蝇到小鼠、人类都存在同源基因，并且在细胞分裂、分化及生殖发育方面有着非常重要的作用。PUF家族蛋白通过结合于目的mRNA的3′UTR的特定序列，并聚集其他促进mRNA降解或影响其翻译表达的蛋白质来调节其表达。PUF蛋白家族大致能够分为4个分支，其中2个分支是细胞质蛋白[5]。啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中的PUF3p，PUF4p和PUF5p是细胞质中PUF蛋白的代表，人类中的PUM1也属于胞质类[4]。

果蝇PUMILIO是最原始的一种PUF蛋白，其识别的RNA序列特异性较为简单，并且可被预测。而FBF显示出与PUMILIO不同的RNA识别特性。Hunchback（hb）mRNA是其中最早发现的一个可被PUF蛋白识别的目标，在果蝇中被PUMILIO识别，其包含一连串的纳米响应原件（Nanos Response Element，NRE），NRE 序列在 hb mRNA 的表达过程和胚胎极性建立的过程中是必不可少的[6]。hb NRE的核心序列（5′-U1G2U3A4-U/C5-A6U7A8-3′）是 PUF 蛋白识别目标位点的模型。所有的PUF蛋白都包含一个特异性序列，即RNA结合域，也被称为Pumilio同源域（Pumiliohomology domain，PUM-HD）或PUF结构域。研究发现[7-8]，PUM-HD包含8个串联的α-螺旋PUF重复单元，整体呈月牙型。PUF蛋白的RNA识别序列起始于5′-UGUR（R代表嘌呤），紧接着是一些可变的3′序列，其中可能包含着一些保守元素[4]。人类PUMILIO1（PUM1）结合于hb RNA的PUM-HD的晶体结构显示了PUF重复单元识别RNA序列的大致原理[9]。RNA结合于PUM1的内凹面，每个PUF重复通过3个保守侧链识别一个RNA碱基，其中，2个侧链与RNA的碱基边缘形成氢键或者分子间作用力，第3个侧链堆叠在同一碱基或前一个碱基。RNA与蛋白质之间“反向平行”，核酸链的1～8位与蛋白质的8～1位分别相互识别（图1-a）[10]。这种简单的一个PUF重复识别一个碱基的识别模式就是典型PUF蛋白识别RNA的基本原理。

1 PUF蛋白的研究现状

1.1 结构研究

人类PUM1与RNA复合体的晶体结构说明特定的PUF重复识别特定的碱基。这种简洁的识别模式暗示着PUF蛋白结合序列的碱基特异性可被定点诱变。这种思路已被用于连接效应器结构域或荧光分子与MS2外壳蛋白，但这需要在目的RNA中插入MS2发卡序列[11]。OPPERMAN[12]研究发现，蠕虫中的2种PUF蛋白可以识别不同长度的核心序列。其中PUF-8识别8个碱基的序列，与hb NRE序列相似，而另一种PUF蛋白FBF更倾向于识别9个碱基的序列，与hb NRE序列相似，但在其第4，5个碱基之间还含有一个额外的碱基。一些研究已经证明，自然环境可以改变PUF蛋白所识别的RNA的特异性。STUMPF等[13]的试验结果显示，在线虫中RNA特异性极其相似的PUF5和PUF6蛋白都含有10个碱基的核心序列，以5′UGU开始3′UGU结束，而这2个蛋白都只含有8个重复序列，说明这些蛋白不是采用一个重复结合一个RNA碱基的模式，其碱基特异性已经被环境所改变。同样，在啤酒酵母中也存在类似的证据。酵母共表达6种PUF蛋白，这些蛋白调节不同的目的RNA[14-15]，基因组学已经发现，其中的PUF4和PUF5分别识别9个和10个碱基的RNA序列。结构生物化学研究进一步阐释了PUF蛋白的特异性如何适应更长的序列。MILLER等[16]用酵母PUF4与其识别RNA序列的晶体结构，揭示了9个碱基的RNA序列如何被8个PUF重复所识别。有了PUF4的晶体结构，就知道了它是如何结合9个碱基的目的序列的，而修饰对特异性的改变是否有影响，相同的原理是否适用于其他PUF蛋白呢？对此，OPPERMAN[12]通过构建嵌合蛋白，证明了PUF蛋白的特异性可以通过改变嵌入碱基附近的蛋白质组分而得到转变。GUPTA[17]用另一种方式研究PUF蛋白对RNA识别序列的适应性，通过研究PUM1结合非同源RNA序列，结果显示，PUM1与2条非同源的RNA序列有相对较高的亲和力，证明了PUF蛋白具有通过游离碱基而优化识别目标的能力，也暗示着PUF蛋白可以进化，从而识别更长的RNA序列。

目前，PUF蛋白与RNA识别特点越来越清晰，我们也更清楚地知道，RNA结合模型是如何识别比从PUM1结构中预期的更大范围的序列。单个重复的适应性和通过把额外的核苷酸游离于RNA结合面以外的适应能力揭示了为什么PUF蛋白间的RNA结合序列是高度保守。

1.2 功能研究

随着PUF蛋白与RNA识别模式的深入研究，更多人把研究重点放在了PUF蛋白的作用上。不同的生物体间编码PUF基因的数量差异非常大，它们在细胞水平上的功能也不尽相同，目前研究的功能已经包括了细胞分化和发育[18-19]、生殖细胞[20]、神经功能与记忆[21-23]、细胞周期[21]以及线粒体生物合成[23]。一直以来，关于PUF的研究都认为，PUF蛋白的典型作用是作为转录后抑制子[4]，除了这个作用，在不同的生物体中，PUF蛋白表现出不同的作用。有试验表明，PUF蛋白还有助于mRNA的激活表达[24-27]和亚细胞定位[28-30]。

WICKENS等[4]首次阐述了PUF蛋白抑制mRNA表达的机制，研究显示，酵母Puf5特异性地直接结合于Ccr4-Pop2-NOTmRNA腺嘌呤酶复合物的Pop2亚基，从而引导腺嘌呤酶到mRNA，这种细胞质核酸外切酶缩短mRNA poly（A）尾巴[31]，对mRNA的稳定性和翻译都产生影响。PUF蛋白的激活子功能是一个新的概念，但在不同的生物体中有越来越多的证据表明PUF蛋白具有该功能[24-27]。目前，基于PUF蛋白的激活机制还没有很明确的定义。有证据显示[24-27]，PUF蛋白对于mRMA的激活作用可能是直接的，PUF蛋白依赖性的调节作用取决于mRNA 3′UTR上的PUF结合位点。果蝇中的FBF被提到可激活另一个mRNA gel4，但其机制还不清楚，很有可能是通过PUF蛋白和microRNA共同合作实现的[26]。非洲爪蟾蜍也是PUF激活转录的一个例子，在其卵母细胞中，Pum结合元件（Pum-binding element，PBE）能促进转录激活，由细胞质聚腺嘌呤基化（cytoplasmic polyadenylation element-binding，CPEB）和其同源的细胞质聚腺苷酸化元件（cytoplasmic polyadenylation element，CPE）介导[24]。但其转录激活的要求非常严格，如果CPE是非典型的，或CPEB出现二聚体，其激活都会失败，这说明Pum的激活作用可能是因为协同作用，从而使CPEB与转录子结合更稳定[24]。动质体目原生动物的寄生虫布氏锥虫（Trypanosoma brucei）中也存在基于PUF蛋白的mRNA激活[27]。Puf9能够在其细胞周期的S期稳定mRNA，Puf9的消耗会减少与其相互作用mRNA的多样性，说明Puf9能够稳定其目标，但若突变Puf9的结合区会导致mRNA的稳定性增加[27]。对此最简单的解释是Puf9与转录抑制子相互竞争目标mRMA 3′UTR序列[27]。对于是否所有的PUF蛋白都是激活子和抑制子，或者仅限定于某些PUF蛋白，这仍然是一个值得研究的问题。

PUF蛋白还具有mRNA定位的功能，对表达的空间控制具有一定的作用。目前，大多数关于PUF蛋白的定位功能都来自于酵母。其Puf3将mRNA定位到线粒体[22，32]，Puf6对ASH1转移到酵母出芽过程中能够促进其不对称定位[15]，Puf5与过氧化物酶体影响PEX14 mRNA的定位[29]。此外，在果蝇的嗅觉神经元中FBF能够激活周围胞体和感觉纤毛egl-4 mRNA的翻译[26]，在哺乳动物中Pum2可能参与定位神经元中mRNA翻译[30，33]。有科学家研究了酵母中Puf6和Puf3的作用机制，研究发现，Puf6调节ASH1 mRNA的翻译和定位[15]，ASH1编码一个只在子细胞中表达的转录抑制子，并不在酵母母细胞中表达。这是由于非对称和编码的mRNA的表达[15]。Puf6结合于ASH1的3′-UTR，通过与翻译起始因子elF5B/Fun12相互作用，从而抑制其在转移到胚芽过程中的翻译[28]。当ASH1 mRNA到达了胚芽的目标位置，Puf6被CK2激酶磷酸化，这影响了Puf6与mRNA的结合，从而开启了ASH1抑制。Puf3与编码线粒体蛋白的mRNA相互作用[14]，并促进其在线粒体中的定位[22]。有试验证明了Puf3在线粒体中的作用，Puf3与线粒体定位mRNA发生免疫共沉淀[14]、puf3诱变体中会出现mRNA的错误定位[23]、Puf3与线粒体的结合是通过其与ERMES（ER-Mitochondria Encounter Structure）的亚基Mdm12相互作用[32]。除了有助于mRNA的定位，Puf3还会抑制其mRNA并使其脱腺苷化[32，34-35]，目前，还不清楚 Puf3在mRNA定位和抑制间有什么联系。

1.3 在植物中的研究进展

目前，大多数基于PUF蛋白的研究都集中在酵母、果蝇等模式生物中，也有科学家研究了拟南芥和水稻中的PUF基因家族，发现这2种模式植物的PUF基因家族成员比其他模式物种多得多，可能是由于整个基因组的复制导致了大量的PUF基因[4]。这些大量的PUF蛋白家族成员暗示着它们在细胞中对相关RNA的稳定和翻译是非常重要的。植物PUF蛋白早期只在关于植物发展史形成的文献中稍有提及[4，36-38]，也有个别文献[39]提到拟南芥中PUF蛋白潜在目标mRNA的鉴定。近年来，有文献[40-41]针对植物中PUF蛋白的作用进行了研究。而植物中由于PUF基因家族数目的庞大，其功能涉及广泛，目前还未研究透彻。

2 结论

最近证据显示，PUF是多功能的mRNA调节子，可以作为抑制子、激活子以及mRNA定位因子。基于这些调节子对细胞分化、发育以及干细胞维持等过程的影响，可以认为，PUF蛋白家族采用多种机制来调节目标RNA，从而行使不同的细胞功能。PUF家族对于RNA定位的广泛作用和其识别作用与mRNA的抑制和激活是如何相互协调的都还不是很清楚。所以，目前需要解决的是PUF蛋白是如何调节众多特定的目标mRNA，是激活还是抑制，或者二者都有？PUF依赖的调节对于细胞内外的信号又是怎样变化的？更多的是，我们应该形成一种mRNA靶向功能的共同认识，这就能更清晰地知道PUF目标mRNA的亚细胞定位以及这种定位是如何依赖于PUF的，并且有助于启发我们去探索基因的时空表达与PUF作用的相互联系。

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