水稻GPH3突变体胚乳贮藏蛋白质蓄积状态的解析

屈雅娟，王益华，岑慧慧，牛鹏飞，郭艳萍，姜建芳，田怀东

（1.山西大学生命科学学院，山西太原030006；2.南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室，江苏南京210095）

水稻是主要的粮食作物。水稻胚乳蓄积可溶于稀酸的谷蛋白、醇溶蛋白以及可溶于中性盐溶液的球蛋白。它们作为贮藏蛋白，为种子发芽及幼苗生长提供代谢用氨基酸，也是食用稻米动物与人群的重要氨基酸源。其中，谷蛋白和醇溶蛋白是主要的稻米贮藏蛋白，分别占种子总蛋白含量的60%～75%和18%～25%[1-3]，对稻米蛋白质的营养品质起着决定性作用。

在发育的野生型水稻胚乳细胞中，醇溶蛋白和谷蛋白在糙面内质网（RER）分别由各自多基因家族的mRNA编码合成后，经过不同的亚细胞区室化过程，蓄积成不同形态的蛋白体（PB）[4-5]。水稻醇溶蛋白在内质网被合成后蓄积成内质网衍生的球状蛋白体（PBⅠ）。水稻谷蛋白以57 ku谷蛋白前体在糙面内质网（RER）中合成后，被输送到液泡，并最终以成熟型的约40 ku酸性组分与20 ku碱性组分蓄积成不规则的液泡型蛋白体（PBⅡ）[4-5]。阐明贮藏蛋白合成蓄积的遗传调控机制对于改善水稻蛋白质营养品质的育种研究具有重要意义。

57 ku谷蛋白前体高量增加的57H突变体是研究水稻贮藏蛋白合成蓄积的有用素材。截至目前，导致成熟型谷蛋白显著减少的4个隐性57H变异已被表明是关于谷蛋白蓄积的基因突变[6-11]。山西大学生命科学学院种质资源遗传实验室从410份来源不同的水稻种质中发掘出3个新型的57H突变体，命名为“GPH系列”。该系列具有57 ku谷蛋白前体大量增加、成熟型谷蛋白未减少的新型性状[12]。其中，GPH1与GPH2兼具13 ku醇溶蛋白缺失的新型性状，而GPH3的醇溶蛋白无变化性状。

本研究以正常型水稻辽盐6号作为对照材料，对 GPH3突变体进行了 SDS-PAGE，Western blot，透射电镜观察蛋白体亚细胞结构等试验，旨在对GPH3突变体水稻胚乳蛋白的蓄积状态进行研究分析，从而得出突变基因对生成胚乳贮藏蛋白过程及其对贮藏蛋白蓄积状态产生的影响。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为正常型水稻品种（辽盐6号）与GPH3突变体籽粒。

1.2 试验方法

1.2.1 SDS-PAGE 参照 TIAN等[7]的方法，将上述供试材料成熟种子的粉末加入提取液（0.125 mol/L Tris-HCl，5% β-巯基乙醇，4%SDS，4 mol/L尿素，5 mmol/L EDTA，2 mol/L PMSF，pH 值 6.8）中，充分提取分离种子蛋白；将所得蛋白用于SDS-PAGE。

1.2.2 Western blot 参照 YAMASHITA 等[13]报道的方法，在上述SDS-PAGE结束后，凝胶不经染色，将分离的蛋白转印到硝酸纤维素膜上，进行抗20 ku谷蛋白碱性组分抗体的免疫反应；使用ECL化学发光试剂盒检测免疫信号，使用Tanon MP软件观察结果。

1.2.3 基于电子染色的透射电镜观察 横切（厚度1～2 mm）开花后12 d的种子，将所得样品置于2.5%戊二醛溶液中固定，在0.1 mol/L磷酸缓冲液（PBS，pH值7.2）中4℃下避光保存。对清洗后的样品在1.5%四氧化锇溶液中2 h，4℃下进行后固定。梯度乙醇中脱水后在树脂中渗透。切片后置于镍网上醋酸双氧铀及柠檬酸染色，并用透射电镜观察。

1.2.4 基于免疫胶体金标记的透射电镜观察 将经固定但不后固定的样品，用LR-White树脂包埋。在切片机上修整样品块，并制备成50～90 nm厚的切片。在镍网上，对所得切片使用3%BSA-PBS封闭20 min后，加入一抗（稀释倍数1∶200）、室温静置2 h，去除液体并用1%的BSA-PBS清洗3次后加入金标二抗（稀释倍数1∶100）、室温静置1 h，后用ddH2O清洗并用醋酸双氧铀和柠檬酸铅双染色后在透射电镜下观察。

2 结果与分析

2.1 GPH3突变体胚乳蛋白体的亚细胞形态学解析

与正常型水稻品种（辽盐6号）相比，GPH3突变体具有色白、粉质的胚乳性状（图1），胚乳贮藏蛋白的SDS-PAGE解析及基于抗20 ku谷蛋白碱性组分抗体标记的Western blot分析显示，GPH3大量增加了57 ku谷蛋白前体，但并未影响对其他贮藏蛋白的性状（图2-A，B）。

将辽盐6号与GPH3突变体的开花后12 d的种子横切试样用于基于电子染色的超薄切片制备与处理，将所得切片用于透射电镜观察（图3）。与已报道的野生型水稻品种一致，辽盐6号的胚乳细胞蓄积了电子染色较浅的内质网衍生型球状蛋白体（PBⅠ）与染色较深的液泡型不规则蛋白体（PBⅡ（图3-A）；而在GPH3胚乳细胞中，除了PBⅠ与PBⅡ外，还出现了由不同染色程度蛋白颗粒组成的内质网衍生型的复合蛋白体结构（图3-B）。这些结果表明，GPH3胚乳细胞中变异型蛋白体结构在内质网位置生成。

2.2 GPH3胚乳贮藏蛋白体的蛋白构成解析

将辽盐6号与GPH3突变体的开花后12 d的种子横切试样用于基于抗谷蛋白抗体免疫金颗粒（6 nm）与醇溶蛋白抗体免疫金颗粒（15 nm）标记的超薄切片制备与免疫处理，将处理后的切片用于透射电镜观察（图4）。与已报道的野生型水稻品种一致，辽盐6号胚乳细胞PBⅠ中蓄积了醇溶蛋白，PBⅡ中蓄积了谷蛋白（图4-A）；而在GPH3胚乳细胞中，生成了由醇溶蛋白抗体标记的蛋白颗粒与分布于其表面的谷蛋白抗体标记的蛋白颗粒构成的复合蛋白体结构（图4-B）。由于在水稻胚乳细胞中成熟型谷蛋白经由谷蛋白前体内切生成并最终蓄积成PBⅡ，所以，判定GPH3变异型复合蛋白体结构中的谷蛋白是谷蛋白前体。

3 结论与讨论

在发育的水稻胚乳细胞中，醇溶蛋白与谷蛋白在糙面内质网分别由各自的多基因家族的mRNA编码合成后，经过不同亚细胞途径，以不同的蛋白体（PB）形态被蓄积起来[1]。通过细胞骨架，醇溶蛋白的mRNA主要被定位在PB-ER上，而谷蛋白的mRNA主要被定位在C-ER上[14-18]。13～14 ku醇溶蛋白是主要的醇溶蛋白，由7～9条多肽链组成；它们被编码合成后，经过肽链的装配与浓缩，被沉积成内质网衍生的PBⅠ[19-21]。

胚乳蛋白体的亚细胞形态学及其免疫细胞化学解析显示，GPH3突变体胚乳细胞中野生型蛋白体的正常形成以及由醇溶蛋白颗粒与谷蛋白前体颗粒构成的内质网衍生型复合蛋白体结构生成。这些结果说明，GPH3变异并非调控贮藏蛋白质翻译后蓄积的基因突变，可能与贮藏蛋白在内质网的合成有关。

参考文献：

［1］OKITA TW，ROGERS J C.Compartmentation of proteins in the endomembrane systemof plant cell[J].Asnnual Reviewof Plant Physiology&Plant Molecular Biology，1996，47：327.

［2］李宗智，娄希祉.我国主要粮食作物品质育种进展[J].河北农学报，1985，10（3）：11-16.

［3］黄英金，刘宜柏.不同类型水稻品种的稻米蛋白质含量及其氨基酸组成的研究[J].江西农业学报，1989（2）：25-31.

［4］王伟权，杨翠平，王景雪，等.水稻谷蛋白GluB-4基因启动子克隆及载体构建[J].华北农学报，2007，22（2）：22-25.

［5］SARKERS C，OGAWA M，TAKAHASHI M，et al.The processing of a 57-kDa precursor peptide tosubunits of rice glutelin[J].Plant Cell Physiol，1986，27（8）：1579-1586.

［6］TAKEMOTOY，COUGHLANS J，OKITA TW，et al.The rice mutant esp2 greatly accumulates the glutelin precursor and deletes the protein disulfide isomerase [J].Plant Physiol，2002，128（4）：1212-1222.

［7］ TIAN H D，SATOH H，TAKEMOTO Y.Inheritance of novel 57H mutations in rice and their effect on compartmentation of endosperm storage proteins[J].INTJ Plant SCI，2004，165（4）：537-544.

［8］WANGY，ZHUS，LIUS，et al.The vacuolar processing enzyme Os-VPE1 is required for efficient glutelin processing in rice[J].Plant J，2009，58（4）：606-617.

［9］WANG Y，RENY，LIUX，et al.OsRab5a regulates endomembrane organization and storage protein trafficking in rice endosperm cells[J].Plant J，2010，64（5）：812-824.

［10］FUKUDA M，SATOH-CRUZM，WENL，et al.The small GTPase Rab5a is essential for intracellular transport of proglutelin from the Golgi apparatus tothe protein storage vacuole and endosomal membrane organization in developing rice endosperm[J].Plant Physiol，2011，157（2）：632-644.

［11］ FUKUDA M，WEN L，SATOH-CRUZ M，et al.A guanine nucleotide exchange factor for Rab5 proteins is essential for intracellular transport of the proglutelin from the Golgi apparatus to the protein storage vacuole in rice endosperm [J].Plant Physiol，2013，162（2）：663.

［12］车倩倩，郭艳萍，李强，等.新型水稻57H突变体的发掘与表征[J].作物学报，2013，39（6）：1054-1059.

［13］ YAMASHITA A，NIJO N，POSPÍSIL P，et al.Quality control of photosystem II：reactive oxygen species are responsible for the damage to photo-system II under moderate heat stress[J].J Biol Chem，2008，283（42）：28380.

［14］LI X，FRANCESCHI V R，OKITA TW.Segregation of storage protein mRNAs on the rough endoplasmic reticulummembranes of rice endospermcells[J].Cell，1993，72（6）：869-879.

［15］WUY，MUENCH D G，KIMY T，et al.Identification of polypeptides associated with an enriched cytoskeleton-protein body fraction from developing rice endosperm[J].Plant&Cell Physiol，1998，39（12）：1251.

［16］MUENCH D G，CHUONG S D，FRANCESCHI V R，et al.Developing prolamine protein bodies are associated with the cortical cytoskeleton in rice endosperm cells[J].Planta，2000，211（2）：227-238.

［17］ CHOI S B，WANG C，MUENCH D G，et al.Messenger RNA targeting of rice seed storage proteins to specific ER subdomains[J].Nature，2000，407：765-767.

［18］CROFTS A J，CROFTS N，WHITELEGGE J P，et al.Isolation and identification of cytoskeleton-associated prolamine mRNA binding proteins from developing rice seeds[J].Planta，2010，231（6）：1261.

［19］ KRISHNAN H B，FRANCESCHI V R，OKITA T W.Immunochemical studies on the role of the Golgi complex in protein-body formation in rice seeds[J].Planta，1986，169（4）：471-480.

［20］王艳平，田孟祥，汤陵华，等.水稻57H谷蛋白突变体的谷蛋白含量分析[J].江苏农业科学，2009（6）：34-35.

［21］韩宝达，李立新.植物种子贮藏蛋白质及其细胞内转运与加工[J].植物学报，2010，45（4）：492-505.