谷子种子DNA快速提取新方法

庞 冰 ，王艳梅 ，郝建平 ,，王陆军 ，王创云 ，李培良 ，邓艳芳，周 琼，李志敏，董永军，张婷婷，裴成成，牛学谦

（1.山西大学生命科学学院，山西太原030006；2.山西省农业科学院作物科学研究所，山西太原030031；3.山西省玉米工程技术研究中心，山西太原030031；4.山西省农业科学院农业科技信息研究所，山西太原030031）

DNA作为分子试验的基础，其质量的好坏决定着试验的成功与否[1]。随着SSR，SNP和基因测序等高通量生物技术的发展，农作物研究需要检测的样本量显著增加，所以，能够在短时间内快速地提取大量高质量样本的DNA，是提高分子试验效率的有效手段[2-4]。

当前，谷子DNA提取的主要方法包括SDS（十二烷基磺酸钠）法、CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）法和高盐提取法等[5-7]。但这几种提取方法均以植物幼叶为材料，需经过3～7 d的发芽期，需要进行液氮研磨，水浴、异丙醇沉淀耗时较长，批量核酸提取工作量繁重[8-10]。

本试验旨在探究直接以谷子种子为材料提取DNA的方法，简化操作流程，缩短提取周期，为谷子高通量分子检测奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

山西省主要谷子种质资源及常规品种如表1所示。

表1 10份材料名称及地理来源

1.2 试剂及主要仪器设备

2%的CTAB分离缓冲液；0.5 mol/L的EDTA；1 mol/L的 Tris-HCl；β-巯基乙醇；TE 缓冲液；氯仿 /异戊醇（24∶1）；异丙醇；琼脂糖；TAE 缓冲液；乙醇（70%）；GelStain。

高速冷冻离心机（Eppendorf 5810R）；PCR仪（eppendorf）；微量紫外分光光度计（北京凯奥5600）；电泳仪（北京君意东方JUNYI3000E）。

1.3 试验方法

1.3.1 谷子基因组DNA提取 取种子0.1 g或幼叶50 mg，机械粉碎；加入 800 μL CTAB 提取液，65 ℃水浴15 min，期间不定期摇匀；加入等体积氯仿/异戊醇，混匀3 min，以12 000 r/min离心5 min，取上清，重复2次；加入0.8倍体积的异丙醇（-20℃预冷），置于-20℃放置5 min；取出后12 000 r/min离心1 min，弃上清；加入500 μL的70%乙醇，摇匀；小心将酒精倒出，自然风干后加入50 μL含RNase的TE缓冲液，保存备用。

1.3.2 DNA质量检测 采用0.8%琼脂糖进行电泳检测；采用紫外分光光度计测定A260/280值及其质量浓度。

1.3.3 SSR-PCR检测 引物名称为 SiGMS462，正向序列：AGGCCCAGTTTAAATGCAAG；反向序列CTAGGAAGCATCATCCTCCG。反应体系（20 μL）：DNA模板60ng；10×Buffer（含MgCl2）2μL；2.5mmol/L dNTPs 1 μL；10 mmol/L 引物各 0.5 μL；2.5 U/μL Taq酶 0.1 μL；ddH2O12.9 μL。反应条件：94 ℃ 5 min；94℃30 s，52℃40 s，72℃ 1 min，循环 35次；72℃延伸10 min。采用0.8%琼脂糖进行电泳检测，120 V电泳45 min。

2 结果与分析

2.1 谷子基因组DNA的纯度与质量浓度分析

采用新方法提取的幼叶DNA质量浓度比种子高，但个体差异较大，最高可达 4 671.88 ng/μL，最低为 2 530.51 ng/μL，总体趋势不稳定；新方法提取的种子DNA总体趋势相对稳定，基本都在2 000～3 000 ng/μL（图1、表2）。采用新方法提取的种子和幼叶的核酸，A260/280值均处于 1.8～2.0（图 2）；经过琼脂糖电泳检测，结果显示，所得条带清晰，一致度高，无拖尾现象，DNA完整性较好（图3）。说明使用新方法提取的种子DNA质量与幼叶一致，无明显差异。

表2 谷子种子与幼叶基因组DNA紫外分光光度计检测结果

2.2SSR-PCR 验证效果

为验证新方法提取的DNA能否用于SSR分子标记试验，采用SSR引物SiGMS462对所提取的谷子核酸进行扩增。从图4可以看出，扩增产物的电泳条带清晰，多态性显著。表明新方法提取的DNA能够满足SSR等分子标记检测对DNA质量与数量的要求。

3 讨论与结论

随着谷子基因组测序的完成，谷子分子标记开发与检测成为当前的研究热点。作为谷子分子标记检测的第1步，核酸提取的结果直接影响下游试验，因此，找到一套简便、高效的DNA提取方法很有必要[11-13]。近年来，人们对于谷子基因组DNA提取方法进行了大量的研究，如碱处理法[14]、高温水煮法[15]、SDS 一步法[16]、TE 研磨法[17]等，这些提取方法速度快、成本低，避免使用液氮研磨、苯酚等有毒化学试剂，甚至将破碎后的提取液直接作为模板，但都存在所得DNA质量不稳定，无法保证后续分子检测的准确性[18-20]。并且所用材料多为谷子的幼叶，需要加入β-巯基乙醇等防止氧化，对人体以及环境会造成一定程度的危害[21-22]。

本试验直接以谷子干种子为材料进行DNA提取，无需经过3～7 d的发苗期，无需液氮研磨，直接通过机械研磨破碎细胞壁，减少了核酸在异丙醇中的沉淀时间，提取过程简便、高效。同时无需加入苯酚、β-巯基乙醇等对人体有害的试剂，所获DNA能够满足SSR等分子检测试验的需求，为实现谷子高通量分子检测奠定了基础。

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