NGS与常规筛查对地中海贫血基因筛查的结果比较

何淑贞，蒲育栋，苏焕厚，曹金如，莫丽芳

地中海贫血是一种遗传性溶血性贫血疾病，由基因缺陷导致机体珠蛋白合成受阻，引起患者贫血或临床病理状态，一般从出生时就出现贫血、黄疸、发育不良等症状[1-2]。地中海贫血是重点防范遗传性疾病之一，华南、西南地区是我国地中海贫血高发地区，特别是广西、广东、四川等地区[3]。因此，孕前或孕期筛查，对预防地中海贫血患儿的出生十分关键。目前临床上主要是针对23种常规地贫基因进行筛查，操作过程复杂，且对检测人员要求较高。而高通量测序技术(NGS)可一次性检测300多种地贫基因，筛查范围广，局限性小。因此，本研究以405例广东籍夫妇为研究对象，探讨NGS与常规筛查方法对地中海贫血基因筛查的结果。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2014年10月～2016年10月在医院进行地中海贫血基因筛查的405例广东籍夫妇为研究对象，其中男147例，女258例；年龄20～35（27.36±4.20）岁。 纳入标准：（1）通过血常规检测，被视为地中海贫血筛查阳性患者[平均红细胞体积（MCV）<82 fl，红细胞平均血红蛋白量<27 pg，满足任意一项，被视为地中海筛查阳性患者]。（2）拟行地中海贫血基因筛查。（3）无其他血液性疾病。排除标准：（1）基本资料不全；（2）患有其他血液性疾病；（3）精神异常或认知功能障碍。本研究获得医院伦理委员会批准。

1.2 检测方法 用EDTA抗凝管采集研究对象外周血，每人2管，每管约2 ml，分别用于常规地中海贫血基因检测和高通量测序地贫基因筛查。

1.2.1 常规筛查 采用跨越断裂点的PCR（gap-PCR）方法：利用基因检测试剂盒（深圳亚能生物技术有限公司）进行基因诊断，检测3种缺失型（-SEA、-α3.7 与-α4.2）α-地中海贫血基因。

采用反向点杂交（RDB）技术，检测非缺失型（HbWS、HbCS 与 HbQS）α-地中海贫血基因突变及17种β-地中海贫血基因突变（包括71/71M、-28M、-29M、31M、32M、CAP、654M、14-15M、17M、41-42M、43M、βEM、27/28M、IVS1-1M、IVS1-5M、IntM、30M）。

1.2.2 高通量测序 血液样本-20℃储存，寄往深圳华大基因公司，经检测合格后，首先进行DNA提取、纯化及质量鉴定，之后文库构建和定量检测，然后采用HiSeq2500（Illumina）测序平台，采用双端测序方法，测序长度为150 bp，进行基因组测序，并进行生物信息学分析。

1.3 观察指标 统计两种方法筛查结果，检测结果均为阴性的排除地贫，检测结果均为阳性者确诊为地贫携带者，计算两组检查结果符合率。对两组结果不一致的样本，进行Sanger验证（缺失重复突变用Q-PCR进行验证），确定相关基因是否变异，分别统计两种方法的假阳性率、假阴性率、检出率，并计算两组每个样本平均检测费用。

1.4 统计学方法 应用SPSS20.0软件分析，计量资料以±s表示，行t检验；计数资料以例和百分率表示，行χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组基因检测结果比较 通过常规筛查、高通量技术及Sanger或Q-PCR验证，共确认249例基因检测为阳性，其中α-地中海贫血基因168例（67.47%），β-地中海贫血基因72例（28.92%），α、β-地中海贫血基因9例（3.61%）。对照组检出221例（88.76%），研究组检测出247例（99.20%），研究组的检出率高于对照组，但差异尚无统计学意义（P>0.05）。

2.2 两组基因筛查结果比较 研究组检测23种常规地中海贫血基因的结果与对照组基本一致（表1）。此外，研究组还检测出25例对照组未检测出的7种突变（4 例 HbHekinan:α27，6 例 HbOwari:α121，3例 HbQ-Thailand:α74，5 例 Hb Hamilton:β11，2 例 Hb New York:β113，3 例 HBB:c.-23，2 例 HBB:c.316-148），与Sanger或Q-PCR验证结果完全一致。

2.3 两组样本平均检测费用比较 观察组每份样本平均检测费用为（550.88±60.31）元，显著高于对照组的（423.47±61.44）元（P<0.05）。

3 讨论

???????? ???????-???? ???? ??????????? n???? n? ???? n? ???? n??-????? ?????? --!"#? $%?--? --? ?? --!"#? $%??? ?? -?&’(? )&?--? --? ?? -?&’(? )&??? -?&’( -?)’*? %?--? --? -?&’( -?)’*? ????? ?? -?)’*? ?$?--? --? ?? -?)’*? ?$?+-????? (*? --? --??! ,! -!./?? $ & $??! ,! -!./?? $ & $??? --? --? )?-)*0? *1? )?-)*0? *1??? --? --? *(-*?0? *? *(-*?0? ?*??? --? --? -*?0? ?? -*?0? ????? --? --? -?(0? 1? -?(0? ?1??? --? --? -)&0? ?? -)&0? ????? --? --? (?-(*0? ?? (?-(*0? ????2+-?????$? ?? --!"#? ???! ,! -! (?-(*0 -?(0??? ?! ,! -! (?-(*0 -?(0? ????? ?? -?&’(? ??-?(0 )?-)*0? ?? -?(0 )?-)*0? ????? ?? -?)’*? ??)?-)*0? ?? )?-)*0? ???34? *)$?**?? ***?

地中海贫血是临床重点预防的遗传性疾病，孕期或孕前地中海贫血基因筛查是防止地中海贫血患儿出生的关键[4-5]。目前临床上常用的基因检测方法大多还停留在跨越断裂点PCR及膜芯片反向杂交联合检测，步骤繁琐，对检测技术人员要求较高，并且跨越断裂点PCR主要是针对α-地贫基因的检测，而膜芯片反向杂交主要是针对β-地贫基因，局限较大[6]。而高通量测序可一次检测338种地中海贫血基因突变，效率较高，且准确率高。

在本研究中，405例疑似地中海贫血症者中，共确认249例基因检测为阳性，其中常规筛查检出221例（88.76%），高通量测序检测出247例（99.20%）。其中NGS检测23种常规地贫基因的结果与常规筛查方法相同。同时研究组还检测出25例对照组未检测出的7种基因突变类型，且与Sanger测序或QPCR验证结果完全一致。提示研究组的检出率高于对照组，同时研究组还检测出对照组未检测出的突变基因型，表明高通量测序技术可提高检出率，且检测范围广、效率高，有利于临床地中海贫血基因的筛查，与陈芳等[7]在母血中胎儿游离DNA进行地中海贫血的无创产前诊断研究结果相似。

高通量测序技术从分子生物学的角度去解读样本的生物信息，具有高效性、广谱性及较高的准确性。本研究结果显示，观察组单个样本基因检测平均费用显著高于对照组（P<0.05），由于NGS需要在华大基因进行检测，所以在费用方面处于劣势。但近年来二代测序平台不断更迭，测序成本正在逐渐下降，因此，未来测序成本将不会是高通量测序技术临床应用的限制因素。

总之，高通量测序技术，检出率较高，筛查范围广，效率高，有利于临床地中海贫血基因的筛查。

【参考文献】

[1]张瀚文,朱宝生.地中海贫血的治疗进展及预防[J].中国妇幼保健,2016,31(3):666-668.

[2]杜萌,朱宝生,吕涛.地中海贫血致病机制及基因治疗进展[J].医学动物防制,2017(1):58-61.

[3]杨阳,张杰.中国南方地区地中海贫血研究进展[J].中国实验血液学杂志,2017,25(1):276-280.

[4]余蕾,张蕾,顾峻嫣,等.高通量测序技术筛查单基因隐性遗传病[J].临床检验杂志,2015,33(7):481-484.

[5]李兵,尹爱华,骆明勇,等.广东省常用的3种β地中海贫血产前筛查方案的临床筛查效果比较[J].中华妇产科杂志,2015(6):434-440.

[6]李朋,张杰.地中海贫血基因检测方法的研究进展[J].中国妇幼保健,2016,31(4):891-894.

[7]陈芳,朱斌,周萍.母血中胎儿游离DNA进行地中海贫血的无创产前诊断研究[J].中国当代医药,2016,23(28):111-113.