肝脏前体细胞移植对CCl4诱导的肝纤维化自发逆转大鼠肝组织学的影响*

陈 辉，任万雷，杨爱婷

肝脏前体细胞（hepatic progenitor cells，HPCs），或称肝内干细胞（在啮齿类动物，称卵圆细胞），是肝脏损伤时一类重要的修复细胞[1-4]。HPCs有别于成熟的肝细胞，位于肝内胆管系统的终末支Hering管，具有多分化潜能、增殖能力强、免疫原性低等特点[5-11]。本研究在CCl4诱导的自发逆转肝纤维化小鼠，将HPCs经脾静脉移植，观察了肝组织学的变化。

1 材料与方法

1.1 动物、细胞与试剂 SPF/VAF级雄性SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，体质量180～200 g，分笼饲养于SPF级动物房内，温度20℃～25℃，相对湿度40%～70%。用杆状饲料喂养，去离子水装入水瓶，供动物自由饮用。实验在首都医科大学附属北京友谊医院动物室进行。大鼠肝脏前体细胞系WB-F344由军事医学科学院裴雪涛教授惠赠。DMEM高糖培养基粉末、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）均购自美国Gibco公司。兔抗大鼠OV6抗体购自美国RD公司，兔抗大鼠α-SMA购自美国Abcam公司，小鼠抗大鼠TIMP-1购自美国Sigma公司。检测大鼠血清Ⅰ型胶原的ELISA试剂盒购自北京蓝鲸公司。检测大鼠白蛋白的ELISA试剂盒购自美国Abcam公司。

1.2 肝纤维化大鼠模型的制备 将24只大鼠适应喂养1 w，将其随机分为4组，每组6只，分别为0 w（对照组）和模型组（4 w、8 w、12 w）。将 20%CCl4溶于橄榄油，给予0.2 ml.100 g-1体质量腹腔注射，2次/w，连续12 w，分别于0 w、4 w和12 w末处死大鼠，取肝组织，每块约1×1×0.5 cm，置于10%中性甲醛中固定。

1.3 前体细胞脾内移植 取WB-F344细胞，经复苏，接种于含10%FBS、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素的高糖DMEM培养基中，37℃、5%CO2孵箱中培养。待细胞贴壁生长，用0.25%胰酶消化、传代。取14只大鼠，给予CCl4腹腔注射，剂量、方法同1.2，连续4 w。在造模成功后，将模型大鼠随机分为自发逆转组（n=7）和 HPCs移植组（n=7）。在HPCs移植组，经脾注射HPCs悬液0.5 ml（5×106个HPCs），在自发逆转组，给予等体积PBS脾内注射。术前，给予大鼠苯巴比妥钠（0.1 ml·100g-1）腹腔注射，行全身麻醉，皮肤消毒，沿腹正中线逐层切开腹部皮肤和肌肉，长约2 cm，打开腹腔。用棉签托出脾脏，吸取细胞悬液，用30G针头沿纵轴刺入脾脏，一边缓慢回抽，一边注射PBS或细胞悬液0.5 ml，见脾脏轻度涨大。轻压穿刺口，待无渗血后，将脾回纳。给予100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素1 ml冲洗腹腔，预防感染。关腹。在脾内注射4 w后，经心脏取血，留取血清，置于-80℃冰箱保存。取肝组织，置于液氮中快速冷冻，置于-80℃冰箱中保存。

1.4 肝组织OV6和α-SMA检测 采用免疫组织化学法，将肝组织切片经60℃烘烤，二甲苯、乙醇脱蜡复水，0.01%枸橼酸钠缓冲液高压修复2 min，自然冷却，滴加3%过氧化氢溶液，37℃孵育15 min，去除内源性过氧化物酶，分别滴加兔抗OV6多克隆抗体（工作浓度1:100）、兔抗α-SMA多克隆抗体（工作浓度1:100），4℃过夜，滴加即用型Maxvision试剂（福州迈新生物技术开发有限公司），室温15 min，DAB（福州迈新生物技术开发有限公司）显色2～5 min，苏木素复染30 s，脱水、透明、封片。在光镜下观察、摄片。同时，每张切片随机取5个视野，采用Image-Pro-Plus6.0图像分析软件测定细胞染色阳性比例。

1.5 肝组织α-SMA和TIMP-1表达检测 采用Western blot法，取肝组织20 mg，加蛋白裂解液1 ml，4℃研磨成匀浆，经离心分离制备蛋白样品。使用BCA蛋白定量试剂盒定量，每组取总蛋白20 μg上样，12%SDS-PAGE分离蛋白质，湿转恒流300 mA 70 min，将蛋白转至硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭2 h，分别加入抗α-SMA（1:1000）和抗 TIMP-1（1:1000），4℃孵育过夜，充分洗涤，分别加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔（1：9 000）、兔抗小鼠第二抗体（1：8 000），室温孵育 1 h，充分洗涤后，发光、显影、定影、曝光、扫描，以α-肌动蛋白（α-actin）为内参照。α-actin用洗膜液（42℃，30 min）洗膜，重新封闭、先后加入一抗（1：4000稀释）、二抗孵育。用扫描仪将硝酸纤维素膜上的蛋白条带扫描至计算机，应用Gel Pro Analyzer software 4.0软件分析目的蛋白条带的灰度值。目的蛋白条带灰度值与内参蛋白（β-actin）条带灰度值的比值即为目的蛋白的相对表达值。

1.6 血清检测 采用ELISA法检测Ⅰ型胶原水平；常规检测ALT和ALB。

1.7 统计学方法 应用SPSS 13.0软件完成统计学处理，计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，采用Pearson法进行相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠肝组织α-SMA和OV-6表达情况 正常肝组织α-SMA表达阳性的细胞为平滑肌细胞，有少量OV6表达阳性的细胞位于胆管附近；在模型组肝组织坏死区周围有大量α-SMA表达阳性的HSCs（即活化的HSC），在汇管区周围有大量OV6表达阳性的HPCs。随纤维化程度增加，α-SMA阳性细胞数量逐渐增加，在CCl4腹腔注射 0 w、4 w、8 w和 12 w，α-SMA阳性率分别为（2.1±0.3）% 、（15.4±4.4）% 、（30.1±4.1）% 、（44.1±7.2）%（P＜0.05），OV6阳性细胞数量随造模时间逐渐升高而后下降，OV6阳性率分别为（2.2±0.30）%、（10.3±1.4）% 、（2 5.5±5.1）% 、（12.6±2.2）%（P＜0.05，图 1）。

2.2 大鼠肝组织病理学变化 自发逆转组肝组织有炎细胞浸润伴假小叶形成，HPCs移植组可见纤维间隔变细，胶原纤维自汇管区或中央静脉延伸明显，未包绕整个肝小叶；天狼猩红染色发现，与自发逆转组比，脾内HPCs移植组肝纤维化程度减轻，胶原面积缩小，两组间差异有统计学意义（图2）。

2.3 大鼠肝组织和血清与纤维化相关指标变化 自发逆转组肝组织α-SMA和TIMP-1蛋白水平显著高于HPCs移植组；自发逆转组血清I型胶原水平显著高于 HPCs移植组（P＜0.05，图 3）。

2.4 大鼠肝功能指标的变化 自发逆转组血清ALT水平显著高于HPCs移植组，白蛋白水平显著低于HPCs移植组，表明细胞移植不仅能够减轻CCl4造成的肝损伤，而且能够改善肝功能。

3 讨论

尽管胚胎干细胞或骨髓来源的间充质干细胞有治疗纤维化的潜能，但相比之下，肝脏前体细胞的肝脏定向性更强，更容易分化成肝细胞或胆管细胞，是更为理想的治疗肝脏疾病的候选细胞[12-14]。研究发现，在肝纤维化时，干细胞表现出类间质细胞样的特性，表现为内皮细胞的标记物表达减少，而间质细胞的标记物表达增加，同时分泌的细胞外基质也增加，最终加重肝纤维化的进展[15，16]。我们既往的研究也发现TGFβ1能促前体细胞分化成类间质样细胞，表现为αSMA表达增加，胶原分泌增加，前体细胞失去特有的极性或锚定依赖性等特点，进而获得间质细胞表型、细胞迁移和合成细胞外基质等间质细胞的功能[17]。最近有研究发现，前体细胞暴露于TGFβ1的不同时间可能影响其对肝纤维化的作用[18]。

图1 两组肝组织α-SMA和OV6表达（200×）和阳性细胞百分比 OV6阳性的HPCs数量在CCl4处理8 w时达高峰，α-SMA阳性的HSCs数量随纤维化程度增加而增加

图2 两组肝组织病理学表现（A、B为HE染色，C、D为天狼星红染色，100×） 与自发逆转组比，HPCs移植后肝纤维化程度减轻，胶原面积减少

对大鼠和人肝纤维化的研究均发现前体细胞与星状细胞关系密切。利用大鼠2-AAF/PH及乙酰氨基酚经典诱导前体细胞激活，发现在星状细胞活化过程中伴随前体细胞增殖，活化的星状细胞与卵圆细胞均位于汇管区，且位置毗邻，随造模时间延长逐步向小叶内迁移。Lorenzini et al[19]发现在慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎患者肝纤维化组织和肝脏受损大鼠/小鼠，激活的肝脏前体细胞常与肝星状细胞伴行，我们既往的研究不但发现在肝纤维化大鼠，前体细胞位于增生的星状细胞周围，而且发现前体细胞的变化与星状细胞的活化及消长有密切关系。因此，我们推测肝纤维化逆转大鼠在接受HPCs移植后，加速了肝纤维化的逆转，可能与其抑制了HSCs的活化有关。

图3 两组与纤维化相关的指标变化

【参考文献】

[1]Karsdal MA，Manon-Jensen T，Genovese F，et al.Novel insights into the function and dynamics of extracellular matrix in liver fibrosis.Am JPhysiolGastrointestLiverPhysiol，2015，308:G807-G830.

[2]Wang P，Koyama Y，Liu X，et al.Promising therapy candidates for liver fibrosis.Front Physiol，2016，7:47.

[3]Wang F，Fan J，Zhang Z，et al.The global burden of liver disease:the major impact of China.Hepatology，2014，60:2099-2108.

[3]Trépo C，Chan HL，Lok A.Hepatitis B virus infection.Lancet，2014，384:2053-2063.

[4]Trautwein C，Friedman SL，Schuppan D，et al.Hepatic fibrosis:Concept to treatment.J Hepatol，2015，62:S15-S24.

[5]Kisseleva T，Cong M，Paik Y，et al.Myofibroblasts revert to an inactive phenotype during regression of liver fibrosis.Proc Natl Acad Sci U S A，2012，109:9448-9453.

[6]Sun Y，Zhou J，Wang L，et al.New classification of liver biopsy assessment for fibrosis in chronic hepatitis B patients before and after treatment.Hepatology，2017[Epub ahead of print].

[7]Schuppan D，Kim YO.Evolving therapies for liver fibrosis.J Clin Invest，2013，123:1887-1901.

[8]Shin S，Kaestner KH.The origin，biology，and therapeutic potential of facultative adult hepatic progenitor cells.Curr Top Dev Biol，2014，107:269-292.

[9]Chobert MN，Couchie D，Fourcot A，et al.Liver precursor cells increase hepatic fibrosis induced by chronic carbon tetrachloride intoxication in rats.Lab Invest，2012，92:135-150.

[10]Parekkadan B，van Poll D，Megeed Z，et al.Immunomodulation of activated hepatic stellate cellsby mesenchymalstem cells.Biochem Biophys Res Commun，2007，363:247-252.

[11]Sangan CB，Tosh D.Hepatic progenitor cells.Cell Tissue Res，2010，342:131-137.

[12]Chobert MN，Couchie D，Fourcot A，et al.Liver precursor cells increase hepatic fibrosis induced by chronic carbon tetrachloride intoxication in rats.Lab Invest，2012，92:135-150.

[13]Lee K，Nelson CM.New insights into the regulation of epithelial-mesenchymal transition and tissue fibrosis.Int Rev Cell Mol Biol，2012，294:171-221.

[14]Kakinuma S，Nakauchi H，Watanabe M.Hepatic stem/progenitor cells and stem-cell transplantation for the treatment of liver disease.J Gastroenterol，2009，44:167-172.

[15]Yovchev MI，Xue Y，Shafritz DA，et al.Repopulation of the fibrotic/cirrhotic rat liver by transplanted hepatic stem/progenitor cells and mature hepatocytes.Hepatology，2014，59:284-295.

[16]Wang P，Liu T，Cong M，et al.Expression of extracellular matrix genes in cultured hepatic oval cells:an origin of hepatic stellate cells through transforming growth factor beta.Liver Int，2009，29:575-584.

[17]Yang AT，Hu DD，Wang P，et al.TGF-β1 induces the dual regulation of hepatic progenitor cells with both anti-and proliver fibrosis.Stem Cells Int，2016，2016:1492694.

[18]Deng X，Chen YX，Zhang X，et al.Hepatic stellate cells modulate the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into hepatocyte-like cells.J Cell Physiol，2008，217:138-144.

[19]Lorenzini S，Bird TG，Boulter L，et al.Characterisation of a stereotypical cellular and extracellular adult liver progenitor cell niche in rodentsand diseased human liver.Gut，2010，59:645-654.