间充质干细胞过表达IL⁃10对心肌梗死模型大鼠心功能的影响

王成 李霞 刘振 韩明磊 侯永兰 齐晓勇

1新乡市中心医院心血管内一科（河南新乡 453000）；2河北省人民医院心内科（石家庄 050051）

近年来，心肌梗死（myocardial infarction，MI）发病率在全球范围内逐步升高，其治愈率低，死亡率高，已成为威胁人类生命的头号杀手［1-2］。目前，临床研究发现，心肌中存在少量干细胞，可减缓MI的恶化及进展同时促进受损区恢复，但由于干细胞量较少，且心肌细胞缺乏增殖分化能力，造成受损区域不能得到完全修复，最终由成纤维细胞填充而形成瘢痕组织［3-5］。由此导致的心室重构是MI患者发生顽固性心力衰竭和死亡的主要原因。现代医学研究显示，将间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）移植到MI部位，可减小梗死面积、抑制心肌纤维化、改善心脏功能［6］。作为近来国内外的研究热点，MSC的功能仍在不断挖掘中。现今，较为认可的方面即是MSC与MI存在某种关联［7］。国外学者GLEESON等［8］人以骨髓来源的MSC为例，对造血干细胞的再生潜能进行了研究，发现其对促进大鼠MI区胶原合成有一定作用，但作用机制并不明确。国内学者耿志敏等［9］亦发现骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）可以促进大鼠 MI后的血管新生，进一步改善心功能；在其实验过程中，肿瘤坏死因子⁃α（TNF⁃α），白细胞介素⁃10（IL⁃10）和白细胞介素⁃6（IL⁃6）均发生了明显变化，然而作者未探究此现象与MSC及MI三者的关联，后续研究仍有必要。笔者查阅资料发现，除了损伤移植后MSC的细胞活性外，上述炎性细胞因子可能是前体细胞损伤后更新活性以及触发病理生理改变的关键点之一［10］。其中，IL⁃10是一种强效的抗炎细胞因子，其治疗心功能障碍的潜力和炎症过程已有文献支持，虽具体作用机制及上下游调控因子尚未得到证实，但此研究方向值得深入探讨。因此，本研究通过对大鼠建立MI模型，真核质粒转染IL⁃10，使其过度表达，观察实验大鼠的心功能指标、炎症因子和凋亡细胞变化，进一步研究MSC移植基础上IL⁃10治疗MI的作用效果及机理。

表1 RT⁃PCR引物序列表Tab.1 Prime sequence of real time fluorescent quantitative PCR

1 材料与方法

1.1 实验材料 SPF级健康雄性SD大鼠若干只，体重均处于（110±20）g，鼠龄4周龄，由上海实验动物中心提供。于20℃恒温下饲养，自由饮水和进食，适应性喂养1周后进行后续实验。

1.2 试剂与仪器 低糖DMEM（hyclone），兔抗鼠Caspase⁃3 一抗、IL⁃10一抗、TNF⁃α一抗、IL⁃1β一抗及GAPDH抗体和辣根过氧化物标记的二抗（北京泰泽瑞达科技有限公司），真核表达载体pcDNA3⁃IL⁃10 及转染脂质体 Lipofectamine2000，Masson染色试剂盒（赛默飞有限公司），免疫荧光试剂盒BPIF30⁃1KT（美国Protein Biotechnologies公司），内切酶HindⅢ、EcoRI及T4连接酶（Promega公司）。MYLAB30.CV彩色多普勒超声诊断仪，Western blot成像系统（创博环球生物科技有限公司），fermentas RT⁃PCR试剂盒及其相应产品，电泳仪（上海伊瑞生物科技仪器有限公司）。

1.3 获取IL⁃10基因组 取大鼠外周血5 mL，分离出单个核细胞，PBS冲洗后于37℃、5%CO2下孵育24 h。根据RNA试剂盒说明书提取总RNA，经逆转录，获得cDNA作为模板，PCR扩增IL⁃10。扩增的IL⁃10具有启动编码序列，未有内终止信号，产物全长660 bp。IL⁃10上游5′端引入酶切位点HindⅢ，下游5′端构建EcoRI的酶切序列，同时引入Kozak序列。扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳，获取目的基因片段。

1.4 构建表达载体 根据Primer 5.0软件设计的HindⅢ、EcoRI将上述片段酶切，获得全长IL⁃10 cDNA；应用HindⅢ、EcoRI双酶切pcDNA3；低熔点琼脂糖回收目的片段，加入TE缓冲液溶解后，运用T4 DNA连接酶连接pcDNA3与IL⁃10cDNA片段，将鼠IL⁃10 cDNA定向克隆至表达载体pcDNA3质粒中；取适量转染产物转化大肠杆菌，同时，接种于氨苄青霉素阳性琼脂平板。室温孵育24 h后，接种针随机挑选部分菌落培养，抽提质粒，并采用酶切鉴定pcDNA3 IL⁃10表达载体。

1.5 MSC的提取、培养及载体转染 实验在经伦理委员会批准后进行。取SD大鼠，脱颈处死后，无菌条件下分离股骨和胫骨；暴露两端骨髓腔后，用吸有低糖DMEM的注射器（5 mL）冲洗骨髓腔，继而反复吹打，形成悬液且骨髓腔呈现白色后收集洗出液，1 000 r/min离心5 min，弃上清，梯度离心后重悬细胞，接种于培养瓶中后置于培养箱中常规培养，每3天换一次培养液，10 d后传代。取传至第3代的MSC，消化、离心、重悬。调整细胞数为1×106/mL，24 h后接种6孔板，确保细胞能铺满孔底50%左右；参照脂质体Lipo2000说明书，将pcDNA3⁃IL⁃10、pcDNA3分别导入 MSC 细胞，以G418（800 μg/mL）进行筛选。于转染结束后24 h后收集细胞培养上清液。用RT⁃PCR方法检测IL⁃10的mRNA的相对表达，以GAPDH为内参照。

1.6 大鼠MI模型的建立 SD大鼠120只，建立MI模型：对所有实验大鼠进行肌肉注射麻醉，固定，乙醇醇消毒，切开气管插入导管，控制呼吸机的压力和频率。沿左侧第4肋间钝性分离，充分暴露胸部后，将心包膜刺穿剥开，采用6-0缝线结扎左冠状动脉前降支；随机分为3组，即实验对照组：结扎冠状动脉后心肌注射MSC与PBS混合悬液（C组）；pcDNA3⁃IL⁃10转染组：结扎冠状动脉后心肌注射转染pcDNA3⁃IL⁃10的MSC悬液（P组）；pcDNA3空质粒转染组：结扎冠状动脉后心肌注射转染pcDNA3的MSC悬液（K组）。MI模型建立后，可见左心室前壁颜色变白，此时，将PBS（混合的细胞悬液）分5点从心外膜注射到梗死区域（半径0.5 cm内），每点0.1 mL，清理干净后逐层缝合，置于恒温恒湿的条件下继续培养。

1.8 术后检测指标 造模后1、2、4周时各组取6只大鼠进行心脏超声检测：大鼠经氯胺酮麻醉后仰卧固定，取右侧卧位，采用GEVIVID7超声仪（10 MHz探头频率）放置胸骨左缘第4、5肋间，分别记录不同时间点下各组的心超指标；同时，计算射血分数（LVEF）与短轴缩短率（FS），其公式为：左心室射血分数=（左心室舒张末横截面积-左心室收缩末横截面积）/左心室舒张末横截面积×100；左室短轴缩短率%=（左心室舒张末内径-左心室收缩末内径）/左心室舒张末内径×100。术后4周时，再次麻醉大鼠，穿刺动脉插入直径为1 mm的聚乙烯导管直至左心室，连接生理记录仪，测量心率（HR）、左心室收缩末压力（LVSP）、左心室舒张末压力（LVEDP），然后计算左心室压最大升降速度（±dp/dtmax）。

1.9 检测各组大鼠梗死区域面积 术后4周检测完左心室功能后，处死大鼠，迅速摘取心脏，用生理盐水冲洗后，沿左室长轴将心脏切成1 mm厚的切片，4%多聚甲醛中固定，常规脱水、石蜡包埋、低温保存、冰冻切片（4 μm）。先用DAB染色，反应5 min；后用苏木素复染，冰醋酸洗净封片后观察。在400倍下每张切片随机选取5个视野，SigmaScan图像处理系统测量左室最短径与最长径、内外周长、弧长，计算梗死面积。

1.10 组织免疫荧光检测Caspase⁃3 取丙酮处理过的冰冻切片，室温复温后加入0.1%Triton X⁃100，浸泡15 min后，1%BSA液封闭1 h，滴入稀释后的Caspase⁃3一抗，4℃孵育过夜。次日，弃一抗，用0.01%PBS洗净，加入荧光标记的二抗，于室温下避光孵育30 min，弃二抗，PBS洗3次，加入DAPI标记细胞核。PBS冲洗后，防荧光淬灭剂封片，采用荧光显微镜×200倍下观察，拍照并计算荧光强度

1.11 Western blot检测相关炎性因子 取梗死区和非梗死区冰冻切片标本，匀浆，加入裂解液提取总蛋白，BCA蛋白质浓度测定试剂盒检测蛋白浓度。SDS⁃PAGE（15%分离胶，5%浓缩胶）凝胶电泳分离后，4℃100 V恒压电泳，蛋白上样后转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭2 h，加入适当稀释TNF⁃α一抗、IL⁃1β一抗4℃过夜，加TBS洗膜后加入HRP标记的IgG二抗，常温孵育1 h。DAB试剂盒显色，分别用TNF⁃α和IL⁃1β与GAPDH条带的吸光面积积分比值来评定各检测因子的表达水平。

1.12 统计学方法 实验中所得到的数据均以SPSS 19.0软件进行分析，定量数据表示方法为均数±标准差。重复测量方差分析不同时间点下各组大鼠射血分数及左室短轴缩短率的差异，同时，采用方差分析探索各组建模后4周的心脏血流动力学指标变化，两两比较采用SNK⁃q检验，以探索过表达IL⁃10对心功能的作用。Caspase⁃3免疫荧光检测结果及TNF⁃α、IL⁃1β蛋白印记结果亦采用方差分析、SNK⁃q检验分析各组结果差异，探索IL⁃10的可能作用机制，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转染后各组IL⁃10 mRNA表达含量 RT⁃PCR检测转染后，各组IL⁃10 mRNA表达含量，其结果显示：与C组相比，P组IL⁃10 mRNA含量较高，差异有统计学意义（P＜0.05）；而K组表达水平近似C组，差异并无统计学意义（P＜0.05），见图1。

图1 转染后各组IL⁃10 mRNA表达含量Fig.1 The expression of IL⁃10 mRNA in each group after transfection

2.2 大鼠术后心超检测结果 由表2可见，术后第7、14及28天，C组、K组大鼠左心室射血分数呈先上升后下降的趋势，上升及下降趋势并不明显，而P组则一直呈上升趋势。比较各时间点下，每组射血分数的差异，可知，各组在不同时间点下，三组射血分数随时间变化并无明显差异（P＞0.05）；C、K两组各点数值相近，无统计学差异，P组各时间点下射血分数远大于前两组（P＜0.05）；组间对比，P组显著高于K 组（FC⁃P=4.382，PC⁃P=0.043）、C组（FK⁃P=8.168，PK⁃P=0.000），差异有统计学意义；处理措施的不同与检测时间存在交互作用，差异无有统计学意义（F交互=2.564，P交互=0.015）。分析各组左室短轴缩短率随时间变化的差异，由表3可知，建模后，各组大鼠左室短轴缩短率并无明显变化趋势，不同时间点下各组数值波动较小，差异无统计学意义（P＞0.05）；从各时间点3组左室短轴缩短率及整体组间比较来看，P组均显著高于C 组（FC⁃P=5.187，PC⁃P=0.000），K 组（FK⁃P=5.084，PK⁃P=0.000）。各时间点下各组检测指标存在交互作用（F交互=2.233，P交互=0.022）。

2.3 三组大鼠心脏血流动力学检测结果 检测过表达IL⁃10后对大鼠心脏血液动力学的影响，结果显示：P组的LVSP显著高于C组、K组，而LVEDP则明显低于前两组，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。三组左室内压变化速率相比，P组+dp/dt⁃max、⁃dp/dtmax较于C、K两组明显增高，差异具有统计学差异（P＜0.01），见图4。

表2 各组大鼠不同时间点下左心室射血分数Tab.2 The left ventricular ejection fraction in each group at different time %，±s

表2 各组大鼠不同时间点下左心室射血分数Tab.2 The left ventricular ejection fraction in each group at different time %，±s

注：FC⁃P=4.382，PC⁃P=0.043；FK⁃P=8.168，PK⁃P=0.000；F 交互 =2.564，P交互=0.015；与C组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01；与K组比较：ΔP ＜0.05，ΔΔP＜0.01

组别C组K组P组术后7 d 36.14±5.06 34.73±4.90 40.25 ± 4.33*Δ术后14 d 37.22±4.56 35.42±3.59 46.67 ± 3.88*Δ术后28 d 35.56±4.81 33.01±5.15 47.51 ± 3.62**ΔΔ

表3 各组大鼠不同时间点下左室短轴缩短率Tab.3 The shortening rate of left ventricular short axis in each group at different time %，±s

表3 各组大鼠不同时间点下左室短轴缩短率Tab.3 The shortening rate of left ventricular short axis in each group at different time %，±s

注：FC⁃P=5.187，PC⁃P=0.000；FK⁃P=5.084，PK⁃P=0.000；F 交互 =2.233，P交互=0.022；与C组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01；与K组比较：ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01

组别C组K组P组术后7 d 35.33±4.32 35.93±4.17 46.46 ± 5.65*Δ术后14 d 36.76±3.48 37.89±4.33 50.22 ± 4.70**ΔΔ术后28 d 38.27±4.01 35.54±4.65 48.34±4.26*Δ

表4 各组大鼠MI面积差异Tab.4 The difference of MI area in each group ±s

表4 各组大鼠MI面积差异Tab.4 The difference of MI area in each group ±s

注：与C组比较，*P＜0.05；与K组比较：ΔP＜0.05

组别P组K组C组梗死面积（%）36.80±3.22*Δ 39.57±2.36 40.32±2.14 F值P值2.4180.017

图4 大鼠心脏血流动力学检测结果Fig.4 The results of cardiac hemodynamics in rats

2.4 各组大鼠MI区域面积比较 三组梗死面积不完全相同，差异具有统计学意义（F=2.418，P=0.017），两两比较可知，C、K两组大鼠梗死面积明显高于P组（P＜0.05）；其两组对比，无差异（P＞0.05）。

2.5 免疫荧光检测结果 免疫荧光结果可知：C、K两组中Caspase⁃3含量较高，荧光强度明显，而P组仅表达少量Caspase⁃3，荧光强度并不明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.6 各组TNF⁃α、IL⁃1β含量检测结果 由Western blot结果可知，术后28 d时K、C两组中MI区瘢痕组织中有大量TNF⁃α、IL⁃1β，表达水平明显高于P组，差异有统计学意义（P＜0.05）。同时，K、C两组相比，蛋白表达含量相差无几（P＞0.05），见图6。

图5 各组Caspase⁃3免疫荧光结果（×200）Fig.5 The immunofluorescence results of Caspase⁃3 in each group

图6 各组大鼠TNF⁃α、IL⁃1β含量检测结果Fig.6 The detection results of TNF⁃and IL⁃1 in each group

3 讨论

MI发生后，梗死部位心肌细胞发生坏死，随即细胞外纤维基质被破坏，导致梗死部位心室壁变薄、室壁应力增高，并可能进一步导致梗死区膨胀扩展，严重者可能形成室壁瘤，甚至发生心脏破裂［11-12］。梗死部位的修复是心室重构发生的主要因素，近年来，大量研究提示，MSC具有较高的可塑性，可促进心肌再生［13］。学者杨跃进等［14］人在研究中提示MSC可移植到心肌损伤部位，参与修复增强血管再生能力，改善局部微环境，修复坏死的心肌组织。虽有MSC损伤修复，但由于心脏原有干细胞较少，修复程度远不及损伤程度，加之MI底层发病机制仍不清楚，MSC修复尚不能达到预期效果。这提示对MSC的研究需要进一步深入，以寻找发挥其价值的靶点。在最新的研究中，学者JUNG等［15］人发现IL⁃10可通过刺激巨噬细胞极化及成纤维细胞活化改善MI。亦有学者提出MI实质上抑制了抗炎性细胞因子的产生，骨髓间充质干细胞的抗炎作用受到阻碍［16］。目前，MSC、炎症环境与心肌重塑三者的关系在国内属于较新研究点，发掘空间较大，可行性较高。因此，本研究通过移植过表达IL⁃10的MSC到大鼠MI部位周围，观察其对心脏梗死大鼠心脏功能及相关炎症因子的影响。

IL⁃10是一种多细胞源的细胞因子，在促进细胞生长与分化中发挥着重要作用，同时，参与调节机体的免疫和炎症反应。有研究显示，MI的急性反应期和亚急性反应期，细胞内IL⁃10基因表达产物明显上升。中性粒细胞富集向梗死区移动，联同巨噬细胞清除坏死细胞［17-18］。这提示，IL⁃10可能对MI大鼠具有保护作用。在本研究中，以MSC为工具，转染pcDNA3⁃IL10到大鼠中，使之过表达，RT⁃PCR检测转染效果。确认转染成功后，进行后续实验。于术后1、2、4周分别检测各组大鼠射血分数及左室短轴缩短率，从结果可知，P组射血分数、左室短轴缩短率均高于C、K两组，与正常值相近。这提示在基于MSC移植上过表达IL⁃10可改善射血功能、左室收缩功能，进一步提高心肌供血能力。为进一步探究大鼠心功能指标的变化，本研究在大鼠建模后第4周，检测了各组大鼠的心脏血液动力学指标，包括LVSP、LVEDP和±dp/dtmax。结果显示，P组大鼠术后28 d后心脏LVSP和±dp/dtmax的数值均高于C组、K组，而LVEDP显著低于两组，这提示P组大鼠的心脏功能的恢复水平优于C、K组，这可能是因为IL⁃10的过表达促进了MSC的抗炎过程，抗炎作用的增强可抑制其他炎性因子的作用，减轻梗死后急性炎症期反应，利于心脏自身分泌促血管生成因素，重建坏死心肌血运。

细胞凋亡是梗死心肌区域细胞死亡、数量减少的机制之一，主要表现为凋亡信号通路的启动和相关基因的表达，而Caspase⁃3是细胞凋亡基因中较为重要的一项，其控制凋亡的作用已等到公认［19］。在本研究中，采用免疫荧光技术检测转染IL⁃10后MI大鼠细胞中Caspase⁃3的表达含量。从结果可知，P组Caspase⁃3蛋白表达含量远低于C组、K组。这提示IL⁃10的过表达可抑制Caspase⁃3基因的表达，减缓心肌细胞凋亡的程度，此现象与学者赵洋等［20］人的研究结论一致。

与其他心脏病一样，MI主要病因与心脏中炎性介质的激活紧密相关。吴志林等［21］人的研究表明大鼠心肌缺血/再灌注损伤模型中炎性反应明显增强。近年来大量研究显示，炎症因子在调控心肌结构和功能中起着不可或缺的作用。TNF⁃α、IL⁃1β作为促炎因子中典型的两类，在梗死后各个阶段均呈显著增长趋势，使组织坏死、器官功能障碍的发生几率明显增加。在本研究western blot结果提示，P组TNF⁃α、IL⁃1β蛋白含量显著低于C、K组，而C、K组无明显差别，提示IL⁃10抗炎因子表达水平的增加，可使TNF⁃α、IL⁃1β表达含量减少，利于心肌细胞的恢复及心室重构。这可能是MSC转运IL⁃10提高MI大鼠心功能的作用机制，但仍需进一步的实验验证。由此，笔者将在日后的工作中，深入探究IL⁃10抗炎因子调控的信号通路及上下游因子的具体作用，以验证我们的实验结论。综上所述，MSC转导IL⁃10可促进MI发生后心功能的恢复，这可能与IL⁃10过表达抑制Caspase⁃3凋亡基因及TNF⁃α、IL⁃1β炎性因子的表达相关。

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