关于Tollip在宫颈癌发生过程中的作用及机制探讨

李 婷 朱建福 毛瑛玉 林茂华 林妙春 沈丽蕊

（1 福建医科大学附属闽东医院病理科，宁德 福安 350000；2 福建医科大学附属闽东医院骨科，宁德 福安 350000；3 福建医科大学附属闽东医院中心实验室，宁德 福安 350000）

宫颈癌占女性全身肿瘤的5%～6%，发病率呈上升趋势[1]。近年来，因高危型人乳头瘤病毒检测、薄层液基细胞学（TCT）、疫苗的应用，宫颈癌早期检出率明显上升[2]。宫颈癌的发生的分子机制并不完全清楚，Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）4在宫颈癌的发生中起着重要作用，与正常组织相比，TLR4在宫颈癌中的表达明显增高。髓样分化蛋白88（MyD88）依赖性途径是TLRs主要的细胞内信号转导途径，可能参与了宫颈癌的发展[3]。本文进一步研究Tollip介导信号转导在宫颈癌发生发展中的作用，并探讨其调控机制，为临床防治宫颈癌提供新的思路和靶点。

1 材料与方法

1.1 材料：实验标本来自于2012年～2014年在本院接受手术治疗的宫颈上皮内瘤变及宫颈癌的患者的切片及蜡块。共收集正常宫颈组织、CIN1、CIN2、CIN3及宫颈浸润癌癌组织各80例。纳入标准：①术前未行放疗或化疗，已行HPV检测，术后诊断经病理学检查证实；②临床资料完整；③新鲜组织取自子宫全切除术及宫颈癌根治标本。

1.2 仪器与试剂

1.3 方法

1.3.1 实验一：①收集并统计各组HPV感染情况；②宫颈鳞状上皮凋亡的检测：a.用Tunel技术原位检测细胞凋亡；b.用免疫组织化学的方法，以cleaved Caspase-3抗体检测细胞的凋亡。③宫颈癌相关基因Cyclin D1、c-Myc、p53表达情况：各组织切片后，采用免疫组织化学的方法，检测Cyclin D1、c-Myc、p53在各组中的表达情况。④MyD88、TLR4、Tollip的表达情况：①组织切片后，采用免疫组化方法检测MyD88、TLR4、Tollip蛋白的表达情况。②采用RT-PCR的方法检测MyD88、TLR4、Tollip的mRNA的表达。

1.3.2 实验二：①实验分组：正常鳞状上皮组，Siha组，Siha+Tollip质粒转染组，Siha+空质粒对照组。Tollip的细胞转染行预实验选取最佳的浓度及时间，荧光显微镜观察细胞转染率，以选取最佳的转染条件。②各组细胞处理后，提取其总RNA，用实时定量RT-PCR检测转染Tollip质粒后的Tollip mRNA表达情况；用免疫荧光观察Tollip的蛋白表达情况，以确定我们对MyD88信号通路干预手段切实有效。

1.4 统计学处理：采用Image Pro Plus统计软件6.0进行统计学计算，阳性标记细胞百分率表达水平服从正态分布采用（Mean±SD）符号（±s）表示，比较采用t检验或配对t检验，相关性分析Spareman相关性分析，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 实验一：正常宫颈组织、CIN1、CIN2、CIN3及宫颈浸润癌癌组织Cyclin D1、c-myc、p53、TLR4、MyD88、NF-kappaB、Tollip表达率以及宫颈鳞状上皮凋亡率、HPV感染率差异有统计学意义（P＜0.05）。分别将TLR4、MyD88、NF-kappaB、Tollip与Cyclin D1、c-myc、p53、bcl-2、宫颈鳞状上皮凋亡、HPV感染进行相关分析，结果显示TLR4、MyD88与宫颈鳞状上皮凋亡（r=0.484、0.427）、HPV感染（r=0.671、0.405）、P53（r=0.487、0.581）存在相关性（P＜0.05）。见表1。

2.2 实验二：Tollip的细胞转染行预实验选取最佳的浓度为细胞汇合度60%左右，时间5 h。正常鳞状上皮组、Siha组、Siha+Tollip质粒转染组、Siha+空质粒对照组的细胞增殖、培养第3代贴壁生长比重差异显著。见表2。

3 讨 论

本次研究显示，Tollip在宫颈癌发生过程中可能通过过表达抑制TLR4、MyD88、NF-KB表达，上调P53发挥抗癌作用。TLR4、MyD88与宫颈鳞状上皮凋亡（r=0.484、0.427）存在相关性（P＜0.05），提示通路上相关蛋白的表达可能与宫颈鳞状上皮凋亡有关。Tollip的细胞转染后，细胞增殖、迁移明显减弱，提示Tollip可能T通过抑制相关通路的作用，从而影响宫颈癌发生、进展。下调Tollip表达可能会影响宫颈上皮细胞内与凋亡相关基因因子下调，从而抑制细胞的凋亡，不利于肿瘤细胞的清除。有报道显示，TLR4/MyD88/NF-KB通路在宫颈病变中发挥重要作用，起到辅助侵袭、促进增生、血管形成等作用[4]。女性生殖系统解剖特点是其容易受到感染的侵袭，感染、致炎性因子长期慢性刺激会导致TLR4介导TLR4/MyD88/NF-KB通路作用活化，导致NK-KB活化，从而致细胞因子的产生，介导细胞凋亡抑制，导致上皮内瘤变及宫颈肿瘤发生进展。

表1 不同宫颈病理组织相关表达、HPR感染、上皮凋亡情况对比（±s）

表1 不同宫颈病理组织相关表达、HPR感染、上皮凋亡情况对比（±s）

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参考文献

[1] 高婷,李超,梁锌,等.中国癌症流行的国际比较[J].中国肿瘤,2016,25(6):409-411.

[2] 金善,崔满华,李冬,等.TCT及HPV 检查对宫颈疾病筛查价值的meta分析研究[J].肿瘤学杂志,2014,20(3):203-207.

[3] 李婷,朱建福,毛瑛玉,等.髓样分化因子88在子宫颈鳞癌组织中的表达及临床意义[J].临床和实验医学杂志,2017,16(4):339-343.

[4] 吴燕燕,王易.Toll样受体信号通路中MyD88的研究进展[J].免疫学杂志,2012,28(3):262-265.