乳消平丸高效液相指纹图谱的建立及主要成分的测定

李 茜，张 琛，张建春1,#(1.兰州大学药学院，甘肃 兰州 730000； .中国人民解放军第一医院药剂科，甘肃 兰州 730000)

根据中医理论，乳腺增生症乃内伤七情所致，多由肝气郁结引起，由气及血，以致气血结聚，治疗以疏肝解郁、软坚散结为主。乳消平丸可软坚散结、疏肝解郁、清热解毒和消肿疗痈，对乳腺增生有良好的治疗效果；该药临床使用十余年，总效率达到92%，且未见不良反应发生，安全性高。但由于该药处方中药材较多，化学成分复杂，一般采用单一或少数几个指标成分进行质量评价，不能全面反映其内在质量。目前，指纹图谱已成为国内外公认的鉴别中药品种和评价中药质量的最有效手段[1-5]，能够较好地显示中药制剂的整体情况。本研究参考相关文献[6-8]，建立了乳消平丸的高效液相指纹图谱，并测定其中咖啡酸、阿魏酸、甘草苷和甘草酸4种主要有效成分的含量，以实现对乳消平丸更好的质量控制。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1290型高效液相色谱仪，包括Agilent 1290LC色谱工作站、G4 204 A四元泵、手动进样器、G1316C柱温箱及G4 212 A紫外检测器(美国安捷伦科技公司)；BP221S 型电子天平(德国赛多利斯公司)；超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；沃特浦实验室超纯水机(四川沃特尔水处理设备有限公司)。

1.2 药品与试剂

咖啡酸(批号：110885—200102)，阿魏酸(批号：110773—200611)，甘草苷(批号：111610—201106)和甘草酸铵(批号：110731—201317)，均购自中国食品药品检定研究所。乳消平丸[解放军第一医院自制制剂，批准文号：兰制字(2011)F01 019号，批号：20160318—20160328]。甲醇和乙腈为色谱纯；其他试剂为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～15 min，10%A；16～30 min，15%A；31～40 min，20%A；41～50 min，25%A；51～60 min，30%A)；流速为1 ml/min；检测波长为360 nm；柱温为30 ℃；进样量为10 μl。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液：精密称取乳消平粉末5 g置于具塞锥形瓶中，加入甲醇20 ml，称定质量，超声处理30 min(功率：250 W，频率：60 kHz)，放冷，再称定质量，用溶剂补足减失质量，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.2.2 混合对照品储备溶液：精密称取对照品适量，加甲醇溶解并制成每1 ml含咖啡酸61 μg、阿魏酸91 μg、甘草苷46 μg和甘草酸铵88 μg的混合对照品储备溶液。

2.2.3 阴性对照溶液：除去处方中的蒲公英、当归和甘草后，按制备工艺制备阴性样品，按“2.2.1”项下方法制备成阴性溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察：分别精密量取混合对照品储备液各1、2、4、6及8 ml置于10 ml容量瓶中，加甲醇至刻度，即得对照品混合溶液。分别精密吸取上述溶液各10 μl，按照“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以质量浓度(μg/ml)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，应用Excel软件绘制标准曲线，结果见表1。

表1 咖啡酸、阿魏酸和甘草苷的线性关系考察结果Tab 1 Results of linearity of caffeic acid, ferulic acid and liquiritin

2.3.2 稳定性试验：取乳消平丸(批号：20160318)5 g，精密称定，按“2.2.1”项下方法制成供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件分别在室温下(25 ℃)放置0、2、4、8、12及24 h后进样测定，分别以咖啡酸、阿魏酸、甘草苷和甘草酸铵为参照峰计算指纹图谱中峰的相对保留时间及相对峰面积。结果显示，各共有峰相对保留时间RSD为0.03%～0.41%，相对峰面积RSD为0.49%～0.97%，且咖啡酸、阿魏酸、甘草苷和甘草酸铵峰面积的RSD分别为1.32%、1.19%、1.18%和1.11%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.3 精密度试验：取乳消平丸(批号：20160319)5 g，精密称定，按“2.2.1”项下方法制成供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，分别以咖啡酸、阿魏酸、甘草苷和甘草酸铵为参照峰计算指纹图谱中峰的相对保留时间及相对峰面积。结果显示，各共有峰相对保留时间RSD为0.57%，相对峰面积RSD为0.01%～0.03%，且咖啡酸、阿魏酸、甘草苷和甘草酸的RSD分别为1.13%、1.02%、1.72%和1.68%，表明精密度良好。

2.3.4 重复性试验：取乳消平丸(批号：20160318)6份，每份约5 g，精密称定，按“2.2.1”项下方法制成供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，分别以咖啡酸、阿魏酸、甘草苷和甘草酸铵为参照峰计算指纹图谱中峰的相对保留时间及相对峰面积。结果显示，各共有峰相对保留时间RSD为0.01%～0.36%，相对峰面积RSD为0.19%～0.92%，且咖啡酸、阿魏酸、甘草苷和甘草酸峰面积的RSD分别为 1.41%、1.47%、1.49%和1.90%，表明重复性良好。

2.4 指纹图谱的建立和相似度分析

取10批乳消平丸(批号：20160318—20160327，标记为S1—S10)，按“2.2.1”项下方法制成供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定。采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)”，建立乳消平丸指纹图谱的共有模式，获得了30个共有峰。计算指纹图谱中咖啡酸、阿魏酸、甘草苷和甘草酸铵峰的相对保留时间和峰面积比。以共有模式为参照，计算样品与共有模式之间的相似度，结果见表2。10批样品的色谱叠加图见图1。

2.5 乳消平丸中4种成分的测定

2.5.1 加样回收率试验：取已知含量的同一批乳消平丸样品(批号：20160318)约2.5 g，共6份，精密称定，分别精密加入阿魏酸、咖啡酸、甘草苷和甘草酸铵对照品适量，按“2.2.1”项下方法制成供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率，见表3。

表2 10批样品指纹图谱的相似度分析结果Tab 2 Results of similarity analysis on 10 batches of samples in fingerprint chromatography

图1 10批乳消平丸高效液相色谱叠加图Fig 1 Stacking chart of HPLC of 10 batches of Ruxiaoping pills

2.5.2 含量测定：取乳消平丸3批(批号：20160318—20160320,标记为S1—S3)，按照“2.2”项下制备供试品溶液、对照品溶液和阴性对照溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定乳消平丸中咖啡酸、阿魏酸、甘草苷和甘草酸铵的含量，见表4，色谱图见图2。结果表明，咖啡酸的出峰时间为10.95 min，阿魏酸为19.37 min，甘草苷为22.46 min，甘草酸铵为24.55 min。供试品溶液中都有显著峰与对照品相对应，且阴性中无此吸收峰，表明对实验结果无干扰。

3 讨论

乳消平丸主要由瓜蒌、蒲公英、昆布、荔核、海藻、当归、浙贝母、元胡、穿山甲、天仙子及甘草组成。本方中的瓜蒌、蒲公英、昆布、海藻、浙贝母及荔枝核等清热解毒、软坚散结的药材为君药；当归、元胡及穿山甲可补血活血、通经下乳，为臣药；天仙子平喘、安神，为佐药；甘草调和诸药，为使药。本研究选取蒲公英、当归和甘草的主要成分苦咖啡酸、甘草苷、甘草酸和阿魏酸作为含量测定的指标成分[9-13]，研究方法可操作性强，能控制乳消平丸的质量。中医药在预防和治疗乳腺增生症方面，有着独特的优势与潜力，在内科辨证论治的基础上结合外治疗法不失为治疗该病的良法。相信随着研究的不断深入，中医学对乳腺增生症的认识及防治将会不断地丰富和发展，为中医学的发展及妇女健康保健做出更大的贡献。

表3 加样回收率试验结果Tab 3 Results of sample recovery tests

表4 3批样品中咖啡酸、阿魏酸和甘草苷的含量测定结果Tab 4 Results of content determination of caffeic acid, ferulic acid and liquiritin in 3 batches of samples

1.咖啡酸；2.阿魏酸；3.甘草苷；4.甘草酸；A. 对照品混合溶液；B.供试品溶液；C.阴性对照溶液1.caffeic acid；2.ferulic acid；3.licorice glycosides；4.glycyrrhizic acid；A. contrast the mixture solution；B.test solution；C.negative control solution图2 乳消平丸的高效液相色谱图Fig 2 HPLC chromatograms of Ruxiaoping Pills

参考文献

[1]杨燕梅，黄得栋，卢有媛，等.黄管秦艽UPLC指纹图谱研究[J].中药材，2016，39(8)：1734-1737.

[2]苏建，刘永利.清火栀麦胶囊HPLC特征图谱的建立和3种成分的测定[J].中成药，2016，38(4)：810-815.

[3]郑华，蔡雨，苏志恒，等.湿毒清胶囊高效液相色谱指纹图谱[J].中国实验方剂学杂志，2016，22(2)：59-62.

[4]石伟，李家春，杨素德.六味地黄软胶囊HPLC指纹图谱研究[J].中国中药杂志，2014，39(23)：4625-4628.

[5]黄旭东，刘伟，徐新元，等.宁心宝胶囊指纹图谱研究及4种核苷类成分的含量测定[J].中国药师，2016，19(3)：488-491.

[6]张德珂，马传江.HPLC法同时测定不同产地生白术中阿魏酸和咖啡酸的含量[J].中国药师，2016，19(3)：594-595.

[7]范开苒，姜英，程岚，等.HPLC法同时测定参归中风康复颗粒中芍药苷、阿魏酸含量[J].辽宁中医药大学学报，2016，18(1)：67-68.

[8]李喆，潘书洋，李超生，等.甘草HPLC指纹图谱研究[J].中国药师，2013，16(8)：1105-1108.

[9]谢京晶，于玥，王一涛，等.HPLC法同时测定当归药材中6种成分的含量[J].药物分析杂志，2007，27(9)：1314-1317.

[10] 秦伟瀚，郭延垒，花雷，等.HPLC法测定滇芹中3种苯丙酸类成分的含量[J].云南农业大学学报：自然科学，2017，32(6)：207-210.

[11] 胡伟慧，韩东岐，江坤，等.RP-HPLC法同时测定甘西鼠尾草中12种成分的含量[J].药物分析杂志，2016，36(3)：486-493.

[12] 任莹，范姣姣，张鑫.HPLC法测定复方双花片中绿原酸、咖啡酸、连翘苷、穿心莲内酯和木犀草素[J].现代药物与临床，2017，32(7)：1192-1195.

[13] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].2015年版.北京：中国医药科技出版社，2015.