猪Gasp1和Gasp2基因对C2C12细胞分化的影响

樊爽爽，张雪梅，刘晓贺，刘姣扬，明胜利，褚贝贝，杨国宇，王 江

(河南农业大学 农业部动物生化与营养重点开放实验室，河南 郑州 450002)

在骨骼肌的生长和发育过程中，肌肉生长抑制素 (Myostatin,MSTN) 是一种重要的细胞因子，参与肌肉生长的负调控[1]。肌肉细胞分化复杂过程的顺利进行是由一组特异的成肌调控因子、生长因子、激酶等精确调控来完成的，这一过程中生肌调节因子(MyoD)、肌细胞生成素(MyoG)、细胞周期抑制物(P21)、肌球重链蛋白(MHC)等基因发挥着重要作用[2-6]。MyoD蛋白和生肌决定因子(Myf5)是生肌调节因子家族(MyoGenic regulatory factors,MRFs)的成员。自Wyzykowski等[7]首次克隆人MyoD基因， 其在促使平滑肌细胞、原代培养的成软骨细胞等骨骼肌细胞分化中的作用陆续被证实[8]。MyoG蛋白为肌细胞生成素，是转录因子MyoD家族的成员之一，在MyoD、Myf5下游表达，进而终止细胞增殖，是骨骼肌发育的正调控因子，具有调节成肌细胞融合形成多核肌管的分化标志特征[9-11]。P21作为衰老细胞衍生的抑制蛋白质参与调节机体细胞衰老过程。在成肌细胞分化过程中，细胞周期抑制物P21基因的特征变化是表达显著增强，提示细胞不可逆地退出细胞周期[12]。有研究表明，体外培养细胞中，MyoD能够增加MHC报道基因的表达[3-6]。Gasp1(Growth and differentiation factor-associated serum protein-1) 蛋白和Gasp2蛋白是卵泡抑素亚家族成员，具有2个相似的蛋白酶抑制剂结构域[13]。通过荧光素酶报告基因分析，Gasp1蛋白被证实具有抑制成熟的肌肉生长抑制素生物活性[14]。Gasp1和Gasp2蛋白可以强有力结合生长因子TGF1 (Transforming growth factor-1)、骨形态发生蛋白-2(Bone morphogenetic protein-2,Bmp2)、骨形态发生蛋白-4(Bone morphogenetic protein-4,Bmp4)，但是却并不抑制它们的信号通路活性[15]，同时还可以阻断MSTN蛋白等配体的活性，进而促进肌肉生长发育[16-17]。Gasp1和Gasp2基因虽然在编码蛋白质上高度同源，但在人机体各个组织中表达存在差异，进而提示两者可能具有不同的生物学功能。此外，许多基于小鼠模型的研究指出，Gasp1基因可以直接但不独立地结合成熟的肌肉生长抑制素、肌肉生长抑制素前肽，从而抑制肌肉生长抑制素活性，促进细胞分化[18-19]。目前，关于Gasp1和Gasp2在骨骼肌生长发育调控中参与的分子机制研究较少，在猪的骨骼肌生长发育及调控中的作用尚不清楚。为此，研究Gasp基因对C2C12细胞分化的影响，为进一步选育优良转基因猪肉新品系提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 Q5 PCR高保真扩增酶、限制性内切酶购自NEB公司；DNA切胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自上海生工生物工程有限公司；质粒中提试剂盒购自QIAGEN公司；Trizol、转染试剂Turbofect购自Thermo公司；高糖DMEM培养基、孕马血清购自Hyclone公司；胎牛血清、胰蛋白酶购自Gibco公司；T4 DNA连接酶、反转录试剂盒、DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker、SYBGreen实时荧光定量PCR试剂盒、rTaq酶、E.coliDH5α感受态细胞购自TaKaRa公司；嘌呤霉素(Puromycin)购自Sigma公司； phiC31质粒购自SBI公司；EB替代物购自上海莱枫生物科技有限公司。

1.1.2 试验材料 小鼠成肌细胞(C2C12)、杜长大三元猪组织为本实验室保存。采用常规方法取猪的心脏、肝脏、肾脏、脾脏、十二指肠、直肠、回肠、肌肉等8种组织，在液氮中速冻，保存于-80 ℃冰箱。

1.2 方法

1.2.1 猪组织总RNA的提取及cDNA的合成 用Trizol试剂提取1.1.2中组织的RNA，用微量分光光度计检测总RNA的纯度和浓度。 以提取的总 RNA 为模板，取1 μg总RNA，使用TakaRa公司反转录试剂盒合成cDNA，-20 ℃保存。

1.2.2 引物设计与合成 从NCBI的GenBank数据库检索得到猪Gasp1和Gasp2基因(GenBank No.：XM_021064627、XM_021083248)的cDNA序列及其相关信息。根据猪Gasp1和Gasp2基因的序列采用Primer Premier 5.0软件设计引物，克隆引物序列见表1，实时荧光定量PCR引物序列见表2。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.3Gasp1和Gasp2基因的克隆 以猪肌肉组织cDNA作为模板，用Q5 PCR高保真扩增酶进行目的基因Gasp1和Gasp2的扩增。反应结束后，PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，然后用DNA胶回收试剂盒进行纯化回收，回收的PCR产物用紫外分光光度计检测吸光值，初步确定扩增的Gasp1和Gasp2基因的质量，置于-20 ℃保存备用。

表1 基因克隆引物

注：F中下划线部分为BamHⅠ酶切位点，R中下划线部分为NheⅠ酶切位点。

表2 实时荧光定量PCR引物

1.2.4 重组质粒的构建 用限制性内切酶BamHⅠ、NheⅠ分别对PCR扩增的Gasp1和Gasp2基因以及phiC31载体进行双酶切，经1.0%的琼脂糖凝胶电泳，切胶回收相应大小的目的片段。按T4连接酶说明书进行目的片段和phiC31载体的连接，连接体系为：纯化的Gasp1和Gasp2基因片段6 μL，双酶切phiC31载体片段1 μL，T4连接酶1 μL，T4连接酶Buffer 2 μL，体系配制完成后，充分混匀各组分，16 ℃反应过夜。第2天将连接产物转化入E.coliDH5α感受态细胞中，经100 μg/mL 嘌呤霉素筛选、菌液PCR检测和测序来鉴定阳性重组质粒。将测序正确的菌液扩大培养，按照QIAGEN试剂盒说明书提质粒。

1.2.5 重组质粒转染细胞 转染前8 h将处于对数生长期的C2C12细胞以 2×105个/孔的密度接种于6孔板，待细胞生长达75%融合度时，按phiC31、phiC31-Gasp1和phiC31-Gasp2重组质粒各2 μg、转染试剂Turbofect 4 μL、DMEM培养基200 μL反应体系加入试验组孔中，设置空白对照组C2C12、试验组C2C12-phiC31-Gasp1和phiC31-Gasp2及阴性对照组C2C12-phiC31。6 h左右换液，48 h后加入含有最佳筛选质量浓度为4 μg/mL嘌呤霉素的新鲜培养基，继续培养，以杀死没有转染进含嘌呤霉素筛选标记质粒的细胞。培养2周后，用荧光显微镜观察荧光蛋白表达。

1.2.6 细胞增殖速度测定 当细胞生长至90%融合度时，将试验组C2C12- phiC31-Gasp1和phiC31-Gasp2、阴性对照组C2C12-phiC31细胞，接种到96孔板中。每种细胞设3个重复，共5 d，以培养基为空白对照。然后将培养板放在CO2培养箱中培养。细胞增殖速率按CCK-8试剂盒说明书进行检测。记录检测的吸光度值，取平均值，以培养时间为横坐标、吸光度A值为纵坐标，绘制细胞的生长曲线。

1.2.7 C2C12细胞的诱导分化 培养C2C12细胞时，待细胞融合度达70%时，将生长培养基换为含有2%马血清的分化培养基进行诱导分化。每个试验组分1、2、3、4、5、6 d共6个时期，分别在细胞分化1、2、3、4、5 d时收集细胞，采用实时荧光定量PCR检测MyoD、MyoG、P21及MHC肌细胞分化相关基因的表达变化。

1.2.8 实时荧光定量PCR检测肌细胞分化相关基因的表达 将上述诱导培养的细胞系C2C12-phiC31、C2C12-phiC31-Gasp1和phiC31-Gasp2接种到6孔板中，待细胞生长达90%融合度时，按试剂盒说明使用Trizol一步法提取总RNA，逆转录为cDNA。将各试验组细胞cDNA样品作为反应模板进行荧光定量PCR。反应体系为：cDNA 1.25 μL,SYBR MIX 5 μL,上下游引物各0.1 μL,ddH2O 3.55 μL。每个样品设3个重复。反应参数:95 ℃预变性2 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40个循环。反应结束后根据Ct值计算标准曲线斜率，根据溶解曲线判断产物特异性。以GAPDH为内参，以设置的对照组mRNA表达量作为对照组,对目的基因mRNA相对表达量进行计算。

1.2.9 统计学分析 荧光定量结果应用MXPro-MX3000P 软件(Stratagene，美国)进行分析处理。根据标准曲线及荧光曲线的Ct值，采用2-△△Ct法进行数据分析。结果均以平均数±标准误表示，并利用GraphPad Prism 5.0软件和t检验进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 Gasp1和Gasp2基因PCR扩增结果

采用Trizol法从猪肌肉组织中提取RNA并反转录为cDNA，然后以肌肉cDNA为模板扩增猪Gasp1和Gasp2基因编码区，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，在1 755 bp和1 659 bp处有特异性条带出现，目的片段大小与预期结果相符 (图1)。

M：DL2000 DNA Marker；1：Gasp1基因；2：Gasp2基因

2.2 重组质粒鉴定结果

使用BamHⅠ、NheⅠ限制性内切酶分别对phiC31载体和2.1中PCR回收产物进行双酶切，经1.0%的琼脂糖凝胶电泳，切胶回收相应目的片段。T4连接酶16 ℃过夜连接后转化，挑选阳性单菌落送至上海生工生物工程有限公司进行测序分析。测序正确后，扩大培养提取质粒，用BamHⅠ、NheⅠ限制性内切酶对中提质粒进行酶切鉴定，获得phiC31和目的基因相对应的大小片段(图2)。

M：DL5000 DNA Marker；1：重组质粒phiC31-Gasp1；2：重组质粒phiC31-Gasp2

2.3 Gasp1和Gasp2基因表达检测结果

待细胞融合度达到75%时，将重组质粒转染至C2C12细胞，培养48 h后，用含4 μg/mL嘌呤霉素培养基筛选，筛选2周后，未转染重组质粒的C2C12细胞死亡，转染重组质粒的细胞大量增殖，在荧光显微镜下观察发现绿色荧光充满视野。结果表明，成功构建稳定表达C2C12-phiC31、C2C12-phiC31-Gasp1和C2C12-phiC31-Gasp2的细胞系(图3)。

A:空白对照；B:C2C12-phiC31；C:C2C12-phiC31-Gasp1；D:C2C12-phiC31-Gasp2

2.4 Gasp1和Gasp2基因过表达对C2C12细胞生长的影响

在生长至第2、3天时，细胞C2C12-phiC31-Gasp1 和C2C12-phiC31-Gasp2增殖能力强于阴性对照组C2C12-phiC31细胞。而到第5天后，细胞C2C12-phiC31-Gasp1和C2C12-phiC31-Gasp2增殖能力低于阴性对照组C2C12-phiC31细胞(图4)。

图4 过表达Gasp1和Gasp2基因对C2C12细胞生长的影响

2.5 Gasp1和Gasp2基因过表达对C2C12细胞分化的影响

在诱导分化2 d后直到分化末期，稳定表达Gasp1和Gasp2的C2C12细胞的MyoG、MHC、P21基因表达量相对于同期对照组显著增强。在分化初期MyoD表达无差异，分化末期稳定表达Gasp1和Gasp2的C2C12细胞MyoD表达量显著增强。同时用生物统计学方法对表达量进行分析发现，稳定表达Gasp1和Gasp2对C2C12细胞分化的促进效果显著 (图5、6)。

*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)，下同

图6 稳定表达Gasp2对C2C12细胞分化的影响

3 结论与讨论

肌肉质量和功能的改善对于选育优良转基因猪肉新品系具有重大的意义[20-21]。卵泡抑素(Follistatin，FST)作为一种有效的肌肉生长抑制素拮抗剂，在小鼠中的过表达可以促进肌肉生长[16，22]。生长和分化因子相关的分泌蛋白Gasp1，含有与蛋白酶抑制性蛋白相关的多个结构域，也含有高度保守的半胱氨酸富集序列，称为卵泡抑素结构域。有研究显示，FST相关基因编码的蛋白质与卵泡抑素高度相似，在体外均可以抑制激活素和多种骨形态发生蛋白[13]。Hill等[14]研究显示，Gasp1能够直接且独立地与成熟的肌肉生长抑制素和肌生长抑制素前肽结合，并在体外抑制肌生成抑制素活性。Gasp1和Gasp2蛋白具有54%的同源性，并且在包括骨骼肌在内的相似组织中表达(少数例外)[23]。与其同源蛋白Gasp2一样，Gasp1对调节轴骨架中前/后模式的生长转化因子(Growth differentination factor 11,GDF11)也有很高的亲和力。与Gasp1不同，Gasp2从未被发现与血清肌肉生长抑制素相关，尽管它们的相互作用是众所周知的[24]。本试验利用真核表达载体phiC31551A过表达，不需要外界化学能源和蛋白质辅助因子、适合大片段基因有效整合，可在多种真核细胞环境中发挥自主作用，并使转基因持续高效表达，外源基因进入细胞后能够与细胞基因组整合进而产生永久性表达[25-26]，从而获得稳定表达Gasp1和Gasp2基因的细胞株。成肌细胞的增殖和分化是一个相互拮抗的过程[27]，这与本试验结果一致。采用CCK-8法测定细胞生长曲线，结果显示，猪Gasp1和Gasp2基因在促进C2C12细胞分化的后期,细胞C2C12-phiC31-Gasp1和C2C12-phiC31-Gasp2增殖能力低于阴性对照组C2C12-phiC31细胞。采用实时荧光定量PCR检测MyoD、MyoG、P21及MHC分化相关基因的表达变化，发现Gasp1、Gasp2基因可以促进肌肉细胞分化，为进一步阐明猪Gasp1、Gasp2基因在肌肉分化中的分子机制提供理论依据，同时为选育优良转基因猪肉新品系奠定了理论基础。

参考文献:

[1] Thomas M,Langley B,Berry C,etal.Myostatin,a negative regulator of muscle growth,functions by inhibiting myoblast proliferation [J].J Biol Chem,2000,275(51):40235-40243.

[2] Buckingham M,Tajbakhsh S.Expression of MyoGenic factors in the mouse:myf-5,the first member of theMyoDgene family to be transcribed during skeletal MyoGenesis [J].C R Acad Sci Ⅲ,1993,316(9):1032-1046.

[3] Lassar A B,Skapek S X,Novitch B.Regulatory mechanisms that coordinate skeletal muscle differentiation and cell cycle withdrawal [J].Curr Opin Cell Biol,1994,6(6):788-794.

[4] Miyake M,Hayashi S,Iwasaki S,etal.TIEG1 negatively controls the myoblast pool indispensable for fusion during MyoGenic differentiation of C2C12 cells[J].J Cell Physiol,2011,226(4):1128-1136.

[5] Muscat G E,Rea S,Downes M.Identification of a regulatory function for an orphan receptor in muscle:COUP-TF Ⅱ affects the expression of theMyoDgene family during MyoGenesis [J].Nucleic Acids Res,1995,23(8):1311-1318.

[6] Davis R L,Weintraub H,Lassar A B.Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts [J].Cell,1987,51(6):987-1000.

[7] Wyzykowski J C,Winata T I,Mitin N,etal.Identification of novelMyoDgene targets in proliferating myogenic stem cells [J].Mol Cell Biol,2002,22(17):6199-6208.

[8] Wright W E,Sassoon D A,Lin V K.MyoGenin,a factor regulating myogenesis,has a domain homologous toMyoD[J].Cell,1989,56(4):607-617.

[9] Weintraub H,Davis R,Tapscott S,etal.TheMyoDgene family:Nodal point during specification of the muscle cell lineage [J].Science,1991,251(4995):761-766.

[10] Ott M O,Bober E,Lyons G,etal.Early expression of the myogenic regulatory gene,myf-5,in precursor cells of skeletal muscle in the mouse embryo [J].Development,1991,111(4):1097-1107.

[11] Gartel A L,Radhakrishnan S K.Lost in transcription:P21 repression,mechanisms,and consequences [J].Cancer Res,2005,65(10):3980-3985.

[12] Spiller M P,Kambadur R,Jeanplong F,etal.Themyostatingene is a downstream target gene of basic helix-loop-helix transcription factorMyoD[J].Mol Cell Biol,2002,22(20):7066-7082.

[13] Tsuchida K,Arai K Y,Kuramoto Y,etal.Identification and characterization of a novel follistatin-like protein as a binding protein for the TGF-beta family[J].J Biol Chem,2000,275(52):40788-40796.

[14] Hill J J,Qiu Y,Hewick R M,etal.Regulation of myostatin in vivo by growth and differentiation factor-associated serum protein-1:A novel protein with protease inhibitor and follistatin domains[J].Mol Endocrinol,2003,17(6):1144-1154.

[15] Szlama G,Kondas K,Trexler M,etal.WFIKKN1 and WFIKKN2 bind growth factors TGFbeta1,BMP2 and BMP4 but do not inhibit their signalling activity[J].FEBS J,2010,277(24):5040-5050.

[16] Haidet A M,Rizo L,Handy C,etal.Long-term enhancement of skeletal muscle mass and strength by single gene administration of myostatin inhibitors[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(11):4318-4322.

[17] Monestier O,Brun C,Heu K,etal.UbiquitousGasp1 overexpression in mice leads mainly to a hypermuscular phenotype[J].BMC Genomics,2012,13:541.

[18] Barberi L,Dobrowolny G,Pelosi L,etal.Muscle involvement and IGF-1 signaling in genetic disorders:New therapeutic approaches[J].Endocr Dev,2009,14:29-37.

[19] Guardiola O,Lafuste P,Brunelli S,etal.Criptoregulates skeletal muscle regeneration and modulates satellite cell determination by antagonizing myostatin[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2012,109(47):3231-3240.

[20] Minetti G C,Colussi C,Adami R,etal.Functional and morphological recovery of dystrophic muscles in mice treated with deacetylase inhibitors[J].Nat Med,2006,12:1147-1150.

[21] Kota J,Handy C R,Haidet A M,etal.Follistatin gene delivery enhances muscle growth and strength in nonhuman primates[J].Sci Transl Med,2009,1:6-15.

[22] Lee S J,McPherron A C.Regulation of myostatin activity and muscle growth[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,98:9306-9311.

[23] Kondás K,Szláma G,Trexler M,etal.Both WFIKKN1 and WFIKKN2 have high affinity for growth and differentiation factors 8 and 11[J].J Biol Chem,2008,283:23677-23684.

[24] Trexler M,Bányai L,Patthy L.Distinct expression pattern of two related human proteins containing multiple types of protease-inhibitory modules[J].Biol Chem,2002,383:223-228.

[25] Sarkar A,Sim C,Hong Y S,etal.Molecular evolutionary analysis of the widespread piggy Bac transposon family and related “domesticated” sequences [J].Mol Genet Genom,2003,270(2):173-180.

[26] Calos M P.The phiC31 integrase system for gene therapy [J].Curr Gene Ther,2006,6(6):633-645.

[27] Olson E N,Brennan T J,Chakraborty T,etal.Molecular control of myogenesis:Antagonism between growth and differentiation[J].Mol Cell Biochem,1991,104(1/2):7-13.