致病性迟缓爱德华氏菌CA26的分离鉴定及其对鲶鱼免疫因子的影响

阎 华，王 会，于 博*，黄升谋，李云捷，吴进菊，李玉奇

(1.湖北文理学院 化学工程与食品科学学院，湖北 襄阳 441053； 2.襄阳市中心医院，湖北 襄阳 441053)

鲶鱼主要生活在江河、湖泊、水库、坑塘的中下层，多在沿岸地带活动，白天多隐于草丛、石块下或深水底，夜晚觅食活动频繁。鲶鱼为肉食性鱼类，捕食对象多为小型鱼类，如餐条、鲫鱼、鰕虎鱼、麦穗鱼、鲤鱼、泥鳅等。鲶鱼肉质鲜美，营养价值丰富，是餐桌上的一道美食，其野生资源因为气候变化和人为因素影响，已经逐渐减少。目前，湖北省长江沿线已形成了具有相当规模的养殖产业。但是养殖场主片面追求经济效益，高密度养殖和高蛋白饵料投喂鲶鱼，造成鲶鱼生长环境恶化。并且忽视了预防疾病措施，使得鲶鱼传染性疾病发病比较严重，有些养殖场发病率高达50%以上，造成极大的经济损失。鲶鱼血液中矿质元素铁参与合成血红蛋白，有助于红细胞输送氧气和二氧化碳，同样有助于免疫系统发挥作用，提高巨噬细胞的杀菌作用。矿质元素铁也是病原微生物生长的必需元素，有助于提高生长速度。基于此，水产动物通过调控矿质元素铁相关基因表达和调节血液中铁元素质量浓度，从而抑制病原微生物的生长。铁调素蛋白主要由铁调素基因(hepc)表达，在鱼体肝脏细胞中产生的抗菌肽，抑菌活性很强，这种蛋白质主要和机体铁元素联合作用，因此，铁调素蛋白含量和铁元素质量浓度有着重要的关系[1]。白细胞介素炎症因子主要由白细胞介素6基因(il-6)编码，激活蛋白酪氨酸激酶/转录激活因子 (JAK3/STAT3)信号通路从而促进铁调素基因表达，有助于铁调素发挥生物学功能，从而调节机体免疫功能[2]。

湖北省武汉市江夏区凤阳养殖场暴发鲶鱼传染性疾病，其鱼体表面溃疡，严重者口鼻充血、流血，解剖后可见其肝脏、脾脏、肾脏肿大。为了解鲶鱼发病原因，通过平板划线培养的方法对染病鲶鱼中致病菌CA26进行分离纯化，并进行鉴定，检测健康鲶鱼感染致病菌CA26后机体铁元素质量浓度变化，并对肝脏hepc基因、il-6基因、蛋白质酪氨酸激酶基因(jak3)、转录激活因子基因(stat3)的表达情况进行分析，研究致病菌CA26侵染鲶鱼对其免疫因子的影响，明确铁元素相关基因和铁元素质量浓度在受感染鱼体应对致病菌CA26侵染中的具体功能，以期研究致病菌CA26的致病机制，为致病菌CA26的防控奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 供试动物

患病鱼：患病鲶鱼来源于湖北省武汉市江夏区凤阳养殖场，呈典型败血症，其主要症状为行动迟缓，反应迟钝，不摄食，严重者口鼻充血、腹部出血。解剖鱼体可见肝脏、脾脏、肾脏肿大，肠道充血。

健康鱼：健康鲶鱼从湖北省农科院水产养殖基地购买，选择外表健康的鲶鱼幼体，幼鱼平均质量是150 g，平均长度是25 cm。然后将健康鲶鱼随机划分为试验组和对照组，每组有3个平行，每个平行有50尾，总计300尾。

1.2 主要试剂及来源

普通营养琼脂培养基、琼脂糖、溴化乙锭等均购自上海一基实业有限公司，细菌基因组DNA提取试剂盒购自上海英诺生物科技有限公司，氧化酶试剂、API细菌鉴定试剂条及相关配套试剂均购自法国梅里埃公司。

1.3 细菌分离鉴定

1.3.1 细菌的分离 在无菌条件下从患病鲶鱼的肝脏中取样，营养琼脂平板划线分离，30 ℃培养24 h，观察菌落生长情况，若菌落光滑、微凸、圆整、黄色或淡黄色，并有特殊芳香气味，则为疑似菌落。挑取单菌落进行2次纯化，将菌落形态光滑、中间凸起有核、圆形、颜色绿色或深绿色的单菌落进行革兰氏染色镜检。分离纯化培养的菌株低温保存备用。

1.3.2 细菌的生理生化鉴定 应用法国梅里埃生物公司革兰氏阴性或阳性鉴定试剂条、VITEK-32全自动细菌鉴定仪对细菌进行生理生化、革兰氏染色、氧化酶检测。

1.3.3 细菌溶血性毒素基因鉴定 细菌毒素的检测引物参照文献[3-5]设计，由大连宝生物工程公司合成，序列见表1。

细菌DNA制备根据制造商的DNA提取试剂盒产品说明进行。PCR反应溶液(25 μL)包含：12.5 μLTaqMaster Mix、1.0 μLethA引物、1.0 μLethB引物、1.0 μLesaC引物、0.5 μL 16SrRNA引物和1 μL提取DNA，余量为ddH2O。采用下列条件进行PCR扩增：95 ℃变性5 min；95 ℃变性30 s,59 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35个循环周期；最后72 ℃延伸10 min。扩增的DNA片段放置在2%琼脂糖凝胶上水平电泳，1×TAE缓冲液(0.04 mol/L Tris、0.02 mol/L醋酸、0.002 mol/L Na2EDTA)，使用8 μL PCR产物。凝胶使用1 μL/mL溴化乙锭染色30 min，紫外线光照下观察。基因大小标准品是采用100个碱基对的DNA梯度标记物。

表1 毒素检测引物序列和目标基因

1.4 迟缓爱德华氏菌CA26侵染鲶鱼试验

将低温保存的迟缓爱德华氏菌CA26菌株使用平板富集培养基30 ℃培养24 h后，以0.65%高温高压灭菌的生理盐水稀释成2.0×106cfu/mL的菌体，使用一次性注射器向试验组鲶鱼腹腔中注射0.15 mL的菌体，对照组注射0.15 mL的高温高压灭菌的0.65%生理盐水。注射完成后6、12、24、48、72、84、96 h每个平行收集3尾鲶鱼，使用一次性注射器从鲶鱼尾部静脉抽血0.3～0.5 mL。抽血后鲶鱼进行解剖，获得的肝脏置于-80 ℃液氮中保存。

1.5 免疫因子测定

1.5.1 血液中铁元素质量浓度的检测 血液铁元素质量浓度和载铁蛋白质量浓度的检测根据血液铁元素质量浓度和载铁蛋白质量浓度检测试剂盒的说明书进行。紫外分光光度计重复测定样本3次。

1.5.2 肝脏中铁元素质量浓度的检测 使用干法消化的方法测定肝脏铁元素质量浓度[6]：鲶鱼肝脏解冻完成后，使用高温高压灭菌的生理盐水冲洗3次，然后使用滤纸吸干，称质量后放入坩埚中，以600 ℃高温马弗炉灼烧约5 h，样本出现白色或者灰白色时，自然冷却到室温取出，然后加入1∶1的硝酸水混合溶液5 mL，电炉上消化至沸腾，使用滤纸过滤消化液流入50 mL容量瓶，再以双蒸水反复冲洗坩埚以及滤纸，使用滤纸过滤流入上述容量瓶中，最后使用双蒸水定容至刻度，检测备用。使用ICP-AES仪重复测定上述样本3次。

1.5.3 肝脏中铁元素调控基因表达分析 以鲶鱼hepc基因cDNA序列、il-6基因cDNA序列、jak3基因cDNA序列、草鱼stat3基因cDNA序列设计相关引物[7-9]，具体见表2。然后使用RNAiso提取试剂盒(大连宝生物工程有限公司)制备鲶鱼肝脏总RNA，再反转录成cDNA，进行实时荧光定量PCR。这4种基因的相对表达量采用二分法进行计算，以鲶鱼18SrRNA基因的表达量为基准。实时荧光定量PCR反应溶液包含：10.0 μLTaqMaster Mix、0.4 μL引物、2 μL cDNA模板,其余为ddH2O，总体积20 μL。采用下列条件进行扩增：95 ℃变性1 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；每个样本溶解曲线从55 ℃到95 ℃平行检测3次。

表2 鲶鱼铁元素调控基因的实时荧光定量PCR相关引物序列

1.6 数据处理

数据使用SPSS 18.0软件分析，差异显著性采用t检验[10]。数据以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 患病鲶鱼肝脏中分离得到的细菌CA26菌落特性和鉴定

2.1.1 菌落特性 从患病鲶鱼的肝脏样本中分离到病原菌，命名为CA26。培养24 h后，可见黄色、湿润、圆形、略隆起、边缘整齐的菌落(图1)。

2.1.2 生理生化反应及鉴定结果 经纯化分离后的致病病原菌CA26，使用VITEK-32全自动细菌分析仪进行生理生化特性分析，结果发现，该细菌具有鞭毛，具有可活动性，革兰色染色为阴性，细菌形态为短杆状，精氨酸反应为阳性，氧化酶反应为阳性，醋硫胺反应为阳性(表3)。生化反应鉴定致病菌CA26为迟缓爱德华氏菌。

2.1.3 迟缓爱德华氏菌CA26中溶血性毒素基因

ethA、ethB和esaC的PCR检测结果 使用多重PCR检测证实，从患病鲶鱼肝脏样本中分离得到的迟缓爱德华氏菌CA26携带有溶血性毒素基因ethA、ethB和esaC。迟缓爱德华氏菌CA26的16SrRNA基因PCR扩增产物为498 bp，ethA基因扩增产物为265 bp，ethB基因扩增产物为694 bp，esaC基因扩增产物为324 bp(图2)。

图1 患病鲶鱼肝脏中分离得到的细菌CA26培养形态

项目结果项目结果鞭毛+荚膜-革兰氏染色-香豆酸(COU)-细菌形态短杆状精氨酸(ARG)+氧化酶(OXI)+醋硫胺(ACE)+三氯新(DP3)+色氨酸(TDA)-尿素(URE)-棉子糖(RAF)-麦芽糖(MLT)+硫化氢(H2S)+肌醇(INO)+赖氨酸(LYS)-阿拉伯糖(ARA)+七叶树素(ESC)+葡萄糖氧化(OFG)+多膝杆菌素(PXB)-枸橼酸(CIT)-山梨醇(SOR)-甘露醇(MAN)+半乳糖苷酶(ONP)-福寿昔醇(ADO)-鸟氨酸(ORN)-葡萄糖发酵(GLU)+植物尿蓝母(PLI)+阳性生长控制(GC)+乳糖(LAC)-丙二酸盐(MAL)-蔗塘(SUC)+木糖(XFL)+鼠李糖(RHA)+

M：DNA标准品；1：迟缓爱德华氏菌CA26图2 迟缓爱德华氏菌CA26的溶血性毒素基因多重PCR检测

2.2 迟缓爱德华氏菌CA26侵染鲶鱼后对其免疫因子的影响

2.2.1 血液铁元素质量浓度 图3为迟缓爱德华氏菌CA26侵染鲶鱼后6～96 h时血液铁元素质量浓度的变化。与对照组相比，血液铁元素质量浓度出现降低。12 h时，血液铁元素质量浓度从3.4 mg/L下降到1.7 mg/L，差异显著(P<0.05)；24 h时血液铁元素质量浓度从3.7 mg/L下降到1.9 mg/L，差异显著(P<0.05)。

*表示与对照组比较差异显著(P<0.05)，下同

2.2.2 血液载铁蛋白质量浓度 从图4可以看出，与对照组相比，载铁蛋白质量浓度有所增加，但是均没有达到显著水平(P>0.05)。

图4 迟缓爱德华氏菌CA26侵染鲶鱼后其血液载铁蛋白质量浓度的变化

2.2.3 肝脏铁元素质量浓度 与对照组相比，肝脏铁元素质量浓度增加，但是没有达到显著水平(P>0.05)(图5)。

图5 迟缓爱德华氏菌CA26侵染鲶鱼后其肝脏铁元素质量浓度的变化

2.2.4 肝脏hepc基因表达量 鲶鱼受到迟缓爱德华氏菌CA26侵染后，其肝脏hepc基因在6～96 h时的表达量增加，6 h时表达量是对照组的4.5倍，达到显著水平(P<0.05)；12 h时表达量是对照组的4.3倍，达到显著水平(P<0.05)；24 h时表达量是对照组的4.1倍，达到显著水平(P<0.05)(图6)。

图6 迟缓爱德华氏菌CA26侵染鲶鱼后其肝脏hepc基因表达量的变化

2.2.5 肝脏il-6基因表达量 鲶鱼受到迟缓爱德华氏菌CA26侵染后，其肝脏il-6基因在6～96 h时表达量增加，6 h时表达量是对照组的3.1倍，达到显著水平(P<0.05)；12 h时表达量是对照组的3.3倍，达到显著水平(P<0.05);24 h时表达量是对照组的3.5倍，达到显著水平(P<0.05)(图7)。

图7 迟缓爱德华氏菌CA26侵染鲶鱼后其肝脏il-6基因表达量的变化

2.2.6 肝脏jak3基因表达量 鲶鱼受到迟缓爱德华氏菌CA26侵染后，其肝脏jak3基因在6～96 h时表达量增加， 12 h表达量是对照组的3.2倍，达到显著水平(P<0.05)，但未达到极显著水平(P>0.01)(图8)。

图8 迟缓爱德华氏菌CA26侵染鲶鱼后其肝脏jak3基因表达量的变化

2.2.7 肝脏stat3基因表达量 鲶鱼受到迟缓爱德华氏菌CA26侵染后，其肝脏stat3基因在6～96 h时表达量增加， 6 h表达量是对照组的4.8倍，达到显著水平(P<0.05)；12 h时表达量是对照组的5.2倍，达到显著水平(P<0.05)(图9)。

图9 迟缓爱德华氏菌CA26侵染鲶鱼后其肝脏stat3基因表达量的变化

3 结论与讨论

迟缓爱德华氏菌又称迟钝爱德华氏菌或缓慢爱德华氏菌，属于肠杆菌科的爱德华氏菌属，是爱德华氏菌属细菌家族中较早发现的成员之一。近年来，迟缓爱德华氏菌不仅是严重危害水产动物的致病菌，已经在20多种鱼类中引起了病害，如鳗鲡、牙鲆、罗非鱼等，给水产养殖造成了巨大损失；也是一种人、鱼共患病原菌，直接对人类健康造成了威胁[9]。迟缓爱德华氏菌有鞭毛、能运动、无荚膜，革兰氏染色阴性兼性厌氧杆菌。在4～10 ℃能够生长，最适生长温度为25～32 ℃[11]。迟缓爱德华氏菌现在已经被发现主要存在2种溶血性毒素，分别是由气溶素基因(ethA和ethB)和溶血素基因(esaC)编码的气溶素和溶血素。迟缓爱德华氏菌中溶血性毒素会破坏寄主细胞膜，使得细胞内容物泄漏，最终引发寄主细胞死亡。

鲶鱼血液中铁元素可以参与机体多种酶类的合成，同时也合成血红蛋白，作为氧气和二氧化碳运输载体，同时也有助于免疫系统发挥作用，提高巨噬细胞的吞噬作用。矿质元素铁也是病原微生物生长必需元素，有助于提高其生长速度[12]。致病菌和寄主鲶鱼之间通过竞争作用，可以在铁元素质量浓度上达到平衡状态。通过铁元素相关基因调节作用，减少机体游离铁元素质量浓度，增加结合铁元素质量浓度，从而降低致病菌的生长速度以减少其危害程度。

本研究采用平板划线培养的方法对湖北省武汉市江夏区凤阳养殖场患病鲶鱼肝脏进行致病菌的分离纯化，在营养琼脂平板上获得形态完全一致的菌落，将该菌株命名为CA26。全自动细菌分析仪鉴定结果为迟缓爱德华氏菌。迟缓爱德华氏菌CA26人工感染鲶鱼试验中出现的症状与自然病例基本相同。分离菌具有溶血性迟缓爱德华氏菌的典型特征，能分泌具有溶血性、肠毒性和细胞毒性的毒素因子，并能广泛地侵袭健康鲶鱼肾、脾、肺、肝、肌肉和血液等组织器官，造成广泛性出血和全身性器官病变，包括出现肿胀、颗粒变性、玻璃样变、坏死崩解以及红细胞破裂。患病鲶鱼经肉眼观察，体表出现溃疡、疤痕，严重的产生口鼻充血、流血，解剖后其内脏肝、脾、肾肿大，肠道充血。本研究使用VITEK-32全自动细菌分析仪进行鉴定，并用特定的ethA、ethB和esaC基因引物进行多重PCR，证实迟缓爱德华氏菌CA26携带有气溶素和溶血素基因。

本研究检测发现，鲶鱼受到迟缓爱德华氏菌CA26侵染后，其肝脏hepc、il-6、jak3和stat3基因表达量出现显著增加，证明这些基因都有助于鲶鱼机体的免疫反应，具有免疫调节作用，从而调控体内铁元素质量浓度。hepc基因的表达产物有助于抑制肠道铁元素的吸收和肝脏铁的释放以降低游离铁元素质量浓度。前人研究发现，大菱鲆受到迟缓爱德华氏菌侵染后，肝、脾、鳃等组织器官hepc基因的表达量显著升高[10]。鲈鱼受到链球菌侵染后，肝细胞hepc基因mRNA水平明显增加[11]。本研究结果与前人基本一致，健康鲶鱼受到迟缓爱德华氏菌CA26侵染后，肝脏hepc基因表达量有所增加，6、12、24 h时达到显著水平。肝脏il-6基因表达量增加，6、12、24 h时达到显著水平。肝脏jak3基因的表达量增加，12 h达到显著水平。肝脏stat3基因的表达量增加，6、12 h时达到显著水平。因此，il-6炎性因子结合小分子受体后可激活jak3基因，然后激活stat3基因，最后调控hepc基因的表达，从而控制鲶鱼铁元素质量浓度。

综上，湖北省武汉市江夏区凤阳养殖场的鲶鱼致病菌属于溶血性迟缓爱德华氏菌，健康鲶鱼受到迟缓爱德华氏菌CA26侵染后，hepc基因、il-6基因、jak3基因、stat3基因等表达量均上升，从而降低鲶鱼血液铁元素质量浓度，并增加血液载铁蛋白质量浓度，并增加肝脏铁元素质量浓度，有利于提高其机体免疫能力。

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