水通道蛋白- 3在胰腺癌组织中表达上调与分化程度相关

刘为军，张振勇，卿艳萍

(云南省第一人民医院 肛肠科, 云南 昆明 650032)

胰腺癌是消化系统中高度恶性肿瘤，发病率位居第二[1]。该病起病隐匿，确诊时大多数患者已发生远处转移或至晚期，往往丧失了外科手术机会，是病死率极高的恶性肿瘤之一。

水通道蛋白- 3(aquaporin3,AQP3)和其他水通道蛋白一样，是一种内在蛋白，位于细胞膜上，其主要生物学功能是在细胞内控制H2O的进出。近期研究表明，AQP3在细胞中表达异常可能与一些恶性肿瘤的发生发展和侵袭转移密切相关[2]。本研究拟通过检测AQP3在胰腺癌组织及细胞中的表达情况，进一步分析其与胰腺癌临床病理特征的关系，为探讨AQP3在胰腺癌发生发展中的作用机制提供线索。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病例组织来源：选择云南省第一人民医院2014年6月至2017年1月行胰腺癌外科根治术后癌旁组织及癌组织标本共86例。手术时收集同一患者胰腺癌组织及距癌缘5 cm以外的癌旁正常胰组织作为对照。所有标本均并通过本院伦理委员会批准，并经患者知情同意。

1.1.2 主要试剂：鼠抗人β-actin单克隆抗体、兔抗人AQP3单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠二抗和RNA提取试剂(Trizol)(invitrogen公司)，RT-PCR试剂盒(Omega公司)。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR检测mRNA：按照Trizol试剂说明书操作提取组织总RNA，反转录合成cDNA。在PubMed基因库中检索到AQP3与GAPDH的mRNA全基因序列，采用Primer5.0软件设计引物，引物由上海Invitrogen生物技术有限公司合成。预期扩增的AQP3产物长度226 bp,引物序列如下，上游引物：5′-TCAATGGCTTCTTTGACCAGTTCA-3′;下游引物:5′-CT TCACATGGGCCAGCTTCACATT-3′。RT-PCR反应条件：体系总体积为20 μL，分别加入cDNA 1 μL、10×缓冲液2 μL、dNTP(10 mmol/L)0.4 μL、MgCl2(25 mmol/L)1.6 μL、Taq酶(1 U/μL)0.2 μL、上游引物(10 μmol/L)0.5 μL、下游引物(10 μmol/L)0.5 μL、双蒸水13.8 μL。94℃预变性，末次延伸10 min，共25个循环。AQP3的反应条件是：94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min；GAPDH的反应条件：94 ℃ 40 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 2 min。

1.2.2 免疫组织化学染色及结果判定：免疫组织化学染色按试剂盒实验步骤操作。结果判定标准：在胞膜、胞质呈现棕黄色或棕褐色。AQP3免疫组化评分方法：选择5个高倍视野(×200)计数阳性细胞数和细胞总数，得出阳性细胞百分率，分为4个等级：阳性细胞数<5%为阴性，5% ～ 25%为弱阳性，26% ～ 50%为中等强度阳性，>50%为强阳性，分别计为0，1，2和3分。

1.2.3 Western blot检测：分别称取0.1 g胰腺癌组织和癌旁组织，加800 μL全蛋白提取液提取蛋白。各组150 μg上样于5.0%浓缩胶，15%分离胶，行SDS-PAGE电泳分离，转PVDF膜，加一抗及β-actin封闭，4 ℃过夜，加二抗37 ℃条件温育2 h，显影检测。免疫印迹条带的吸光度值经吸光度扫描仪分析后获得。

2 结果

2.1 AQP3 mRNA表达:AQP3在人的胰腺癌组织中表达丰富，癌旁组织中却低表达或没有表达(图1)。

2.2 免疫组织化学染色检测:AQP3主要存在于胰腺癌细胞膜,阳性反应呈棕黄色或棕褐色, 而肿瘤旁组织中未检测到其表达，胰腺癌组织中AQP3表达明显高于癌旁正常组织(P<0.01)(图2)。

2.3 Westen blot结果：AQP3在胰腺癌组织中表达丰富，癌旁组织表达相对较低(图3)。

1.marker; 2.para carcinoma tissue; 3.carcinoma tissue图1 琼脂糖凝胶电泳检测AQP3 mRNA表达Fig 1 Expression of AQP3 mRNA by agarose electrophoresis

A.para-carcinoma tissue; B.carcinoma tissue图2 AQP3的免疫组织化学染色结果Fig 2 Immunohistochemical results of AQP3(×200)

a.para-carcinoma tissue; b,c.carcinoma tissue; *P<0.01compare with control group图3 Westen blot检测AQP3蛋白表达Fig 3 AQP3 expression evaluated by Westen blot

2.4 AQP3阳性率与肿瘤分化程度的相关性:AQP3的阳性率在高分化腺癌(52.9%)显著低于低分化腺癌中(94.1%)。(P<0.01)(表1)。

表1 胰腺癌腺癌组织AQP3阳性率与肿瘤分化程度的关系

*P<0.01 compared with high differentiation.

3 讨论

胰腺癌细胞和其他恶性肿瘤细胞一样，更需要水的快速跨膜转运，以维持此快速、无限的增殖和分裂，在此过程中AQPs可能发挥着极其重要的作用。目前文献报道AQPs与肿瘤的关系在以下几个方面的研究有所进展和突破：1)AQPs除了促进水在肿瘤细胞膜的转运，还可以促进血管内皮生长因子(VEGF)的表达，从而诱导其血管增生和迁移[3]；2)AQPs在肿瘤和正常组织中存在着差异表达；3)应用AQPs阻滞剂可以阻滞抑制恶性肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移[4]。

本研究通过RT-qPCR、免疫组织化学、Western blot检测所得结果均提示，AQP3 在胰腺癌组织丰富表达，癌旁组织中低水平表达或不表达，二者之间存在明显差异。因此，AQP3可能影响了胰腺癌的临床生物学特性，为进一步探讨AQP3在胰腺癌发生发展中的作用机制提供了线索。

参考文献:

[1] Siegel R, Naishadham D, Jemal A. Cancer statistics, 2013 [J]. CA Cancer J Clin, 2013, 63:11- 30.

[2] Rubenwolf P, Thomas C, Denzinger S,etal. Loss of AQP3 protein expression is associated with worse progression-free and cancer-specific survival in patients with muscle-invasive bladder cancer[J]. World J Urol, 2015, 33: 1959- 1964.

[3] Shen Q, Lin W, Luo H,etal. Differential expression of aquaporins in cervical precursor lesions and invasive cervical cancer[J]. Reprod Sci, 2016, 23: 1551- 1558.

[4] Wang J, Feng L, Zhu Z,etal. Aquaporins as diagnostic and therapeutic targets in cancer: how far we are? [J]. J Transl Med, 2015, 13:96- 100.