糖尿病大鼠心肌组织中自噬相关基因Atg7和Atg12-Atg5表达降低

王 艺，王 瑞，张 帅，邓 蕊，胡 峰，陈睿琦，张秀冰，刘晓健

(锦州医科大学 1.第一临床学院 2013级英文班； 2.第一临床学院2012级17班；3.基础医学院 药理学教研室；辽宁 锦州 121001)

自噬是一个降解坏死细胞器及变性蛋白质的过程，在促进细胞存活、维持细胞内稳态和保持细胞健康过程中起着重要作用。研究表明在多种疾病的发生发展与治疗过程中均可有自噬现象的变化[1- 2]。近年来，自噬对糖尿病心肌病的影响也受到重视，但目前研究的自噬在糖尿病心肌损伤中的变化和作用仍结论不一[3- 6]。

Atg (autophagy-related)基因是最先在酵母鉴定出的一组自噬相关基因。自噬过程中涉及一系列的相关基因的表达。其中，Atg12-Atg5缀合物是由一个泛素样的共轭系统形成的，对于自噬的中心事件——自噬体的形成，是至关重要的[7]，而Atg7是活化Atg8(即自噬标志性蛋白LC3)和Atg12的关键上游分子[8]。

本研究应用链脲佐菌素糖尿病大鼠心肌组织探讨糖尿病心肌损伤过程中自噬的变化，为进一步研究糖尿病心肌病的发病机制和干预治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品与试剂：链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)、蛋白酶抑制剂cocktai(Sigma-Aldrich公司)；RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、5×蛋白上样缓冲液(碧云天试剂公司)；GAPDH抗体(Santa Cruz公司)和Atg5和Atg12-Atg5抗体(Cell Signal公司)；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG二抗和山羊抗兔IgG二抗(Earthox公司)；蛋白Marker(Thermo Fisher公司)。

1.1.2 动物：SPF级SD大鼠，雄性，空腹体质量为(235±10)g[辽宁长生生物技术有限公司，SYXK(辽)2014- 0010]。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及处理：将大鼠分为对照组(NC)49只和糖尿病模型(DM)组85只。以尾静脉注射链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)50 mg/kg制备大鼠糖尿病模型，造模成功72只。分别在成模后的第10、20、30、40、60、80和100 d，结束动物饲养。去除成模后死亡8只，血糖回落16只，最终每组动物在每个时间点的数量为6～8只。所有大鼠自由进食和饮水，每周定时监测大鼠的体质量和尾静脉血葡萄糖等情况。

1.2.2 心肌标本收集：经腹腔注射1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉大鼠后，迅速取出心脏，计算左心室质量指数(左心室质量/体重，mg/g)。取部分左心室心肌组织快速放入-80 ℃冰箱冻存，待测蛋白表达。另取一部分大鼠心尖部待进行透射电镜检测。

1.2.3 Western blot检测蛋白表达：冰上剪碎心肌组织后，加入含有1%蛋白酶抑制剂cocktail的RIPA裂解液，冰中超声碎裂组织后，再在冰上裂解40 min，4 ℃以12 000 r/min离心15 min。取上清液，BCA法进行蛋白定量。加入5×样品缓冲液混合后, 煮沸5 min。各个样品取等量总蛋白，经SDS- 聚丙烯凝胶中电泳后转印至PVDF膜上，用1% BSA封闭2 h后, 按预染Marker标记的分子质量剪裁转印膜，分别加入GAPDH、Atg7和Atg12-Atg5抗体，4 ℃摇床孵育过夜。二抗(1∶8 000稀释)室温作用1 h后，ECL法显色，GIS凝胶图像分析系统照相并分析处理。

1.2.4 心肌组织电镜检测：3%戊二醛、1%锇酸先后固定，包埋，制备超薄切片，铀铅双染，透射电镜下观察超微结构。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 左心质量指数

随着鼠龄增长，对照组大鼠的左心质量指数稍有降低，而DM组大鼠的左心质量指数则明显升高(40 d，P<0.05；80 d，P<0.01)(表1)。

表1 糖尿病对大鼠体质量和左心质量指数的影响

*P<0.05,**P<0.01 compared with NC group.

2.2 心肌组织中自噬相关蛋白Atg7和Atg12-Atg5的蛋白表达

随着鼠龄的增加，对照组大鼠的心肌组织中Atg7和Atg12-Atg5蛋白表达呈增多趋势(40 d时，Atg7，P<0.05，Atg12-Atg5，P<0.05；图1A，B)。而在DM组，随着病程的发展，大鼠心肌的Atg7和Atg12-Atg5蛋白表达先稍增加而后则显著减弱(60 d，P<0.05)(图1C，D)。

与同一时间的对照组比较，至80 d时的DM心肌组织中Atg7和Atg12-Atg5的蛋白表达显著降低(P<0.01，图2A，B)。

2.3 DM组大鼠心肌组织中自噬小体减少

对照组大鼠的心肌肌原纤维排列整齐，线粒体呈圆或椭圆形，膜结构清晰，嵴排列规则密集，自噬小体/自噬小泡多见(图3A，B)。DM组大鼠的心肌肌原纤维相对稀疏、排列稍有紊乱、 偶有断裂， 线粒体增多、变圆、膜与嵴结构不清晰，偶见脂滴存在，自噬小体/自噬小泡明显减少(图3C)。

A.representative bands in group of NC; B.quantity results normalized to GAPDH of fig A;**P<0.01,*P<0.05 compared with NC10; C.representative bands in group of NC; D.quantity results normalized to GAPDH of Fig C;**P<0.01,*P<0.05 compared with DM10

A.representative bands; B.quantity results normalized to GAPDH of Fig A; *P<0.01 compared with NC80图2 相同时间点的正常大鼠和糖尿病大鼠的心肌组织Atg7和Atg12-Atg5的蛋白表达

A.ultrastructure of myocardial tissue in the normal rats(×8 000); B.magnified area of the squared area in A(×25 000); C.ultrastructure of myocardial tissue in the diabetic rats(×8 000); the white arrows showed the autophagosomes or autophagic vacuoles

图3正常大鼠和糖尿病大鼠(80d)的心肌组织的超微结构
Fig3Ultrastructureofmyocardialtissueinthenormalratsanddiabeticratsat80days

3 讨论

糖尿病的患病率正以惊人的速度增长，预计到2025年，全球约5%的人口会患有糖尿病；而临床研究表明，心力衰竭的发病率在糖尿病人群中比非糖尿病人群高约2～4倍[9]。因此，研究糖尿病心肌病发生发展相关的新机制,对其防治具有重要的理论意义和实际价值。

目前普遍认为糖尿病心肌病的发生主要与心肌细胞代谢紊乱、心肌细胞钙转运缺陷、冠状动脉微血管病变、心肌间质纤维化和心脏自主神经病变以及氧化应激、细胞凋亡等有关[10]。近年来自噬现象在糖尿病心肌病中的作用也备受重视。细胞可通过自噬为其重建、再生和修复提供必须原料，实现细胞的再循环和再利用。自噬的发生过程是严格受自噬相关基因(Atg)调控的大量蛋白质和蛋白质复合物所控制的，每种蛋白质负责调控自噬体启动与形成的不同阶段。其中，Atg7的蛋白表达与Atg12-Atg5缀合物形成都是重要的调控环节[7]。

本研究以刚成年的SD大鼠建立STZ糖尿病模型，多个时间点观察了左心质量指数及心肌组织中自噬相关基因Atg7和Atg12-Atg5蛋白表达情况。结果显示，随着鼠龄的增长、体质量的增加，左心质量指数在正常大鼠呈现减少趋势，而糖尿病大鼠却呈现上升趋势，特别是60 d后差异更为显著，表明糖尿病随着病程进展引起大鼠心肌出现了明显的病变。通过检测Atg7和Atg12-Atg5的蛋白表达发现，随时间推移，模型组大鼠的心肌表现为先稍增加而后显著减弱的变化，特别是达病程80 d后，左心质量指数与蛋白表达的变化差异均特别显著，提示自噬现象的动态变化可能影响了大鼠心肌组织的病变过程。心肌超微结构的观察结果也显示：与同时间的正常大鼠相比，在病程80 d时，糖尿病大鼠心肌的肌原纤维、线粒体均发生病理改变，同时自噬小体也明显减少。即本研究中，糖尿病病程发展到80 d时，大鼠心肌组织中自噬水平显著降低，与近年来的一些研究结果基本一致[3,5 ]。然而，本研究中对照组大鼠随着鼠龄增加，心肌组织中Atg7和Atg12-Atg5蛋白表达有增多改变，该结果与参考文献[5]报道不一致，可能与实验动物的种类和年龄不同有关，提示进行此类研究，对照组必须是同龄动物。本研究多个时间点的检测结果还显示：在病程早期自噬现象稍有增多改变，虽然未见统计学意义，但至少说明病情发展到一定程度后才出现自噬减少的。该结果提示，可能在糖尿病早期，心肌组织中维持的一定水平的自噬，有利于糖尿病大鼠的心脏形态与功能维持于相对正常状态；而在病程达80 d时，大鼠心肌的病理改变已十分显著，自噬水平也呈现显著降低，其原因很可能是随着糖尿病病情的发展，心肌组织再难以维持一定水平的自噬，而正是由于自噬的明显减少，糖尿病大鼠的心肌组织不能有效地完成氨基酸的再循环与清除受损的细胞器，不能使细胞维持稳态与有效重塑，进而出现显著的心肌组织损伤。

总之，本研究表明了自噬现象在糖尿病心肌损伤过程中发生了明显变化，可能起重要作用，通过干预自噬来预防和延缓糖尿病心肌病的发生发展值得进一步研究。

参考文献：

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[3] Xie Z, Lau K, Eby B,etal. Improvement of cardiac functions by chronic metformin treatment is associated with enhanced cardiac autophagy in diabetic OVE26 mice [J]. Diabetes, 2011, 60: 1770- 1778.

[4] Dutta D, Calvani R, Bernabei R,etal. Contribution of impaired mitochondrial autophagy to cardiac aging: mechanisms and therapeutic opportunities [J]. Circ Res, 2012, 110: 1125- 1138.

[5] Xu X, Kobayashi S, Chen K,etal. Diminished aut-ophagy limits cardiac injury in mouse models of type 1 diabetes [J]. J Biol Chem, 2013, 288: 18077- 18092.

[6] Kanamori H, Takemura G, Goto K,etal. Autophagic adaptations in diabetic cardiomyopathy differ between type 1 and type 2 diabetes [J]. Autophagy, 2015, 11: 1146- 1160.

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[8] Ohsumi Y. Historical landmarks of autophagy research [J]. Cell Res, 2014, 24: 9- 23.

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