利用CRISPR /CAS9技术构建QKI敲除GC1-spg细胞株及其生物学功能检测

钟顺顺，李 凯，杨 阳，缪时英，王琳芳，宋 伟

(中国医学科学院 基础医学研究所 北京协和医学院 基础学院 医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005)

近年来，CRISPR/Cas9技术应用于细胞、动物和植物等方面的研究，对生命科学的研究有重要意义，它相比于传统的基因编辑——锌指核酸酶(zinc-finger nucleases，ZFN)和转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALEN)，更加精准和高效[1]。

QKI(quaking, QKI)是一类RNA结合蛋白质，可通过选择性剪切可转录产生QKI5、QKI6和QKI7 3种转录本，都具有同源的KH结构域[2]。目前，QKI的研究主要集中在神经、 心血管系统等研究领域[3- 5]。在生殖领域，QKI突变的雄性小鼠不育，其睾丸组织切片中几乎没有精子的存在，附睾组织中仅有精子头部和尾部畸形的无运动能力的精子[6]，表明QKI在精子发生中也有重要作用。

目前关于QKI在精子发生中的功能与机制的研究较少，本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建了GC1-spg细胞系的QKI基因中与RNA结合的KH结构(K Homology domain, KH)的敲除细胞株，并从细胞增殖、分化等方面初步探索QKI在精子发生中的可能功能，为深入揭示QKI蛋白在精子发生中的功能和机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

小鼠精原细胞系GCI-spg(本课题组保存)；真核表达质粒px330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(本实验室保存)；转染所用试剂Lipofectamine(Invitrogen公司)；胎牛血清(Gibco-BRL公司)；DMEM培养基(Hyclone公司)；gRNA序列(擎科生物科技有限公司合成)；anti-QKI抗体(Millipore公司)；anti-Tubulin抗体和嘌呤霉素(Sigma-Aldrich公司)；辣根过氧化物酶标记的抗小鼠；兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)；Cell Counting Kit- 8(同仁化学研究所)；Transcriptor First Strand cDNA Synthetsis Kit(Roche公司)；TransStart Tip Green qPCR Super Mix(Transgen Biotech公司)。

1.2 方法

1.2.1 敲除靶点的设计及QKI的测序引物设计：利用麻省理工学院的CRISPR Design：http://crispr.mit.edu/设计QKIDNA区域的一对oligoDNAs，根据得分高低选择合适的一对引导RNA序列。同时，在QKI敲除区域的上下游选择合适的位置设计测序引物，用于后续的PCR鉴定和测序检测。

1.2.2 质粒和重组体的构建：将合成的两条oligo DNAs按照上游下游各100 pmol的比例进行100 ℃反应10 min，后自然降温退火至室温，形成双链DNA，与PX330质粒用T4连接酶连接，进而转化DH5α感受态细胞，筛选出阳性克隆，进行测序确认后，提取质粒备用。

1.2.3 细胞转染及单克隆的筛选：根据GC1-spg细胞的特征，选择Lipofectamine做转染试剂，按照其说明书提供的方法进行转染细胞，待质粒表达36 h后，用加入3 mg/L嘌呤霉素，待阴性对照中细胞完全死亡，停止加药，待细胞长到适当数量，进行单克隆分选，挑选有效单克隆细胞，扩大培养至可用来DNA测序和Western blot验证。

1.2.4 Western blot检测蛋白的表达：将构建成功的PX330重组表达质粒转化GC1-spg细胞，培养48 h后，收取细胞，用1×SDS裂解液(50 μL 1 mol/L Tris-HCl pH 6.8, 125 μL 80%甘油, 10% SDS, 625 μL H2O)裂解细胞样品，致使细胞呈黏稠透明液体，100 ℃变性10 min，后用BCA法进行蛋白定量。SDS-PAGE电泳，分离蛋白，用320 mA进行恒流转膜，后用相应的各抗体进行检测。

1.2.5 CCK8测量增殖曲线：在96孔板中种植一定数量(1 000个)细胞，12 h后待细胞完全贴壁后，加入10% CCK8检测液和90% DMEM完全培养基的混合液。将细胞置于培养箱孵育75 min后，检测450和630 nm处吸光度值，检测细胞增殖情况。

1.2.6 q-PCR对mRNA水平的检测：利用 Trizol法提取细胞中的总RNA，后用Transcriptor First Strand cDNA Synthetsis Kit进行反转录，再进行荧光定量PCR检测c-kit、Stra8、Lhx8、Hspa2、Zfp42和Mtl5的相对表达量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 构建GC1-spg的QKI敲除细胞株

2.1.1 靶点设计示意图：QKI基因敲除靶点位置(图1)，敲除靶点序列长度为20 bp，1#靶点和2#靶点分别位于KH的+67到+86处和+13到+32处(1#靶点序列为：5′-GGATGTAAAATAATGGTCCG-3′，2#靶点序列为：5′-GGGAGAATCCTTGGACCTAG-3′)

2.1.2 Western blot与测序验证敲除细胞株：获得1#靶点单细胞株3株，2#靶点单细胞株3株，Western blot检测结果(图2A)，其中1#06测序结果(图2B)得到GTCCGAG碱基缺失突变体，测序峰图结果(图2C)表明突变细胞株是在该区域因碱基缺失造成移码突变。后续功能检测实验均选择1#06进行实验。

2.2 QKI对GC1-spg细胞增殖与分化的影响

2.2.1 QKI蛋白对于细胞增殖的影响：测定QKI敲除成功的细胞株增殖曲线结果(图3)，实验组Cas-QKI细胞增殖明显慢于对照组(P<0.05)。

图1 QKI基因敲除靶点Fig 1 Diagram of QKI gene target site

A.cells were collected for Western blot; B,C.cells were collected for PCR, and B.sequence PCR product compared with wild type, C.sequencing peak map, the red line marked the mutation

图2敲除细胞株的鉴定
Fig2Identificationoftheknock-outcellstrain

*P<0.05 compared with control group图3 CCK8检测QKI对细胞增殖的影响Fig 3 CCK8 method was used to detect the proliferation of QKI-knocking out cells

2.2.2 QKI蛋白对于细胞分化的影响：检测减数分裂相关分子标志基因的表达水平，发现实验组c-kit、Mtl5的表达量相较于对照组有显著降低(P<0.01)，Hspa2表达量也低于对照组(P<0.05)(图4)。

*P<0.05, **P<0.01 compared with control group图4 QKI蛋白对细胞进入减数分裂的影响Fig 4 Effect of QKI protein on cells’ meiosis

3 讨论

在体外机制的研究中，常用RNA干扰(RNA interference, RNAi)进行基因沉默，影响蛋白质表达，但是由于siRNA的持续作用时间较短，一般传代2～3代就会失效，而且受细胞的转染效率和状态影响大，靶点的敲低效率也不稳定，同时对于一些周期比较长的实验不适用，所以本研究选择利用CRISPR/Cas9构建稳定细胞株，可以解决RNAi的技术弊端。

由于QKI有3个转录本，就其序列进行分析，其3个转录本高度同源，仅在3′端氨基酸序列与个数不同，其QUA结构域具有介导信号传导的作用；KH可以与RNA结合，通过与RNA结合参与生物学过程。本研究利用CRISPR/Cas9技术对GC1-spg细胞的QKI进行KH结构域定点敲除，共筛出6株单细胞(1#靶点3株，2# 靶点3株)。CRISPR/Cas9技术虽然持续周期较长(2个月左右)，但是其敲除效率高，构建出的细胞株可以稳定缺失QKI，构建成功的细胞株不会因为传代次数增多而恢复，所以可以为体外功能与机制研究提供合适的细胞模型。

目前QKI在精子发生中的功能与机制的研究较少，本研究利用上述构建的QKI敲除细胞模型，初步观察了该基因对生精细胞的增殖和分化的影响。

由上述实验结果得出QKI可以影响细胞增殖；在检测c-kit、Stra8和Lhx8这些减数分裂早期关键分子[7- 8]与 Hspa2、Zfp42和Mtl5 等减数分裂后期的关键分子[9- 10]时，c- kit、Mtl5和Hspa2的表达量变化都提示了QKI蛋白在精子发生过程中具有重要作用；这些将为深入揭示QKI蛋白在精子发生中的功能奠定了良好基础。

但是精子发生是一个特殊的分化过程，涉及生物学过程很多，而目前生精细胞在体外的培养和继续减数分裂难度大，本研究中选择的GC1-spg也仅是永生化的精原细胞株，不能全面代表精子发生的整个过程，所以要真正阐释QKI蛋白在精子发生中的功能表型与详细机制，还需进一步结合体内的功能研究。

参考文献：

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