低温胁迫对胡椒叶片生理生化及显微结构的影响

伍宝朵　范睿　胡丽松　杨建峰　郝朝运

摘 要 以胡椒主栽品种热引1号胡椒（Piper nigrum c.v. Reyin-1）和野生近缘种石南藤（Piper wallichii）为材料，经过4 ℃低温胁迫处理，研究其在胁迫条件下植株的伤害情况、叶片解剖结构和生理生化指標变化。结果表明：低温胁迫条件下，石南藤比热引1号胡椒具有明显的耐寒表型，胡椒叶片厚度变化与叶片受害程度相一致；胁迫72 h时，热引1号胡椒保护酶系统被破坏，石南藤则仍然表现活跃；热引1号胡椒的可溶性糖和可溶性蛋白含量呈现升降趋势，石南藤则维持上升；胡椒的丙二醛和脯胺酸含量与其抗寒性呈现负相关。研究结果表明，石南藤为抗寒性种质，其抗寒性比热引1号胡椒强，为开展胡椒抗寒育种和胡椒抗寒分子机理研究提供了材料基础。

关键词 胡椒；低温胁迫；生理生化；显微结构；石南藤

中图分类号 Q949.732.3 文献标识码 A

Abstract Piper nigrum c.v. Reyin-1 and Piper wallichii， treated with 4 ℃ low temperature， were used to study the leaf physiological， biochemical and structural variation. Results showed that the cold resistance of P. wallichii was higher than that of P. nigrum c.v. Reyin-1 based on the phenotype. Leaf thickness variation was consistent with leaf injury. The protection enzyme systems of P. nigrum c.v. Reyin-1 were destroyed， and that of P. wallichii were still active under 4 ℃ for 72 h. The content of soluble sugar and protein of black pepper was positively correlated with cold resistance， while that of malondialdehyde and free proline of black pepper was negatively correlated with cold resistance. It was concluded that the cold resistance of P. wallichii was higher than that of P. nigrum c.v. Reyin-1. These results would provide materials for cold resistant breeding and the molecular mechanism study of pepper cold resistance.

Keywords Piper nigrum； cold stress； physiology and biochemistry； anatomical structure； Piper wallichii

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.08.008

胡椒（Piper nigurm）为胡椒属（Piper）多年生常绿藤本植物，素有“香料之王”的美誉，是世界最重要的香辛料作物[1]。在食品工业上可用作抗氧化剂、防腐剂和保鲜剂；在医药工业上可用作健胃剂、解热剂、利尿剂等；在现代制药、戒毒和军事等领域都有广泛用途[2-5]。目前胡椒种植已遍及亚洲、非洲、拉丁美洲三大洲近20个国家和地区，据联合国粮食及农业组织（FAO）统计，世界胡椒收获面积近50万hm2，总产量近45.4万t。中国胡椒主要分布在海南、云南、广东、广西和福建等省区，种植面积近3万hm2，年产约3.60万t，居世界第5位[6]，其中海南是胡椒主产区，种植面积和产量均占全国90%以上。我国地处热带边缘，胡椒主产区海南和云南冬季常有低温危害，我国胡椒主栽品种热引1号胡椒受寒后易出现落叶、断枝，甚至死亡的现象，且伤口极易感染病害，易给椒农造成严重经济损失[7-8]。低温成为影响我国胡椒丰产稳产和制约胡椒产业健康持续发展的重要因素。因此开展胡椒种质资源抗寒性鉴定，筛选和培育抗性种质（品种）是我国胡椒育种的重要目标。

我国胡椒野生近缘种资源丰富，含有许多具有经济开发潜力的优异资源，为胡椒品种选育和改良提供了重要材料来源[9-13]。石南藤为胡椒科（Piperaceae）胡椒属多年生藤本植物，在印度东北部常被用的叶和果实与咖喱一起做调味品[14]，在中国被作为药用植物，广泛用于治疗风湿性关节炎、炎症、脑梗死以及心绞痛等疾病[15]。石南藤分布在我国甘肃、湖北、湖南、广西、贵州、云南、四川等省区，以及尼泊尔、印度、孟加拉国、印度尼西亚[10]，在自然条件下生长纬度较高，环境适应性强。

本研究通过开展4 ℃低温胁迫条件下热引1号胡椒和石南藤叶片生理生化和显微结构变化研究，鉴定评价两份种质的抗寒性，为进一步研究胡椒抗寒机理提供依据，并为胡椒抗寒育种研究提供优异基因资源。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为热引1号胡椒和石南藤，其中热引1号胡椒是我国胡椒主栽品种，来源于从印度尼西亚引进的印尼大叶种胡椒（Piper nigrum c.v. Lampong），经60多年试种，种植选育而成。石南藤是栽培种胡椒野生近缘种，在我国广泛分布在甘肃、湖北、四川、广东、海南等地，环境适应性强。供试材料保存于中国热带农业科学院香料饮料研究所农业部万宁胡椒种质资源圃。热引1号胡椒和石南藤插条苗按照海南省地方标准“胡椒优良种苗培育技术规程”（DB46/T26-2012）培育，选取生长正常、无病虫害和机械损伤的插条，在温室沙床中培育生根，生根后转移至育苗袋中抚育3个月，转移至人工气候箱中进行低温处理。

1.2 方法

1.2.1 实验设计 选取长势良好、生长一致、无病虫害和机械损伤的袋装苗在人工气候箱（宾德KBWF720，德国）中进行低温胁迫处理，试验设置4 ℃低温胁迫，以30 ℃/28 ℃为对照（CK），光照强度为200 μmol/（m2·s），时间设置为12 h / 12 h，相对湿度保持70%左右，待温度降至待处理温度后开始计时。分别在低温胁迫0、12、24、48、72 h后采集叶片并迅速置于液氮中冷冻，用于测定叶片生理生化变化；以近枝头端第一个完全稳定叶为样品用FAA固定液固定，制作石蜡切片，用于观察叶片解剖结构，重复3次，每次重复5株苗。

1.2.2 测定方法 采用江苏科铭生物技术有限公司测定试剂盒分别测定叶片的POD、CAT、SOD酶活性、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、丙二醛含量、脯氨酸含量等生理生化指标。从第一稳定叶中部切取5 mm×5 mm样品，用FAA固定液固定72 h，在石蜡切片机（徕卡RM2016，德国）上切片，片厚4 μm，用番红-固绿染色液染色，最后在Olympus BX51正置显微镜下观察，并使用CCD相机DP80拍照。测量叶片厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度，每个处理观察3个切片，每个切片观察5个视野，并计算平均值[16]。

组织紧密度（CTR）=（栅栏组织厚度/叶片总厚度）×100%

组织疏松度（SR）=（海绵组织厚度/叶片总厚度）×100%

P/I=栅栏组织厚度/海绵组织厚度

1.3 数据分析

实验所得数据取3次重复的均值，用SPSS统计分析软件进行数据分析，多重比较采用Duncan新复极差法，分别在0.05和0.01水平进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 低温胁迫胡椒植株寒害表现

通过观察热引1号胡椒和石南藤表型发现，CK条件下，热引1号胡椒和石南藤植株生长正常，叶片形状和颜色未见明显变化。4 ℃低温胁迫条件下，热引1号胡椒随胁迫时间延长，植株受害程度越来越严重，胁迫72 h时整株受害严重，叶片受害发黑，而石南藤植株表型无明显变化（表1，图1）。说明4 ℃低温胁迫条件下，石南藤比热引1号胡椒具有明显的耐寒表型。

2.2 低温胁迫对胡椒叶片解剖结构的影响

4 ℃低温胁迫处理下胡椒叶片显微结构变化见图2和表2。结果表明，随胁迫时间延长，热引1号胡椒叶片厚度越来越小，胁迫72 h的叶片厚度比0 h減少了25.08%，达到极显著差异水平；海绵组织和栅栏组织厚度随胁迫时间延长而降低，其中胁迫12 h后栅栏组织和海绵组织厚度比0 h分别减少了24.55%和10.24%，达到极显著差异水平，胁迫24 h后栅栏组织和海绵组织细胞出现失水变形和排列混乱的现象，边界不能区分，胁迫72 h后叶片各组织细胞都严重失水，结构受到严重破坏变形。石南藤叶片厚度在低温胁迫后变化不明显，仅72 h时厚度显著变小；栅栏组织也有随胁迫时间延长而降低，其中胁迫24 h和72 h比0 h分别减少了10.43%和5.95%，胁迫72 h后，石南藤下表皮和海绵组织细胞排列紊乱。说明低温胁迫后，热引1号胡椒叶片厚度越来越小，24 h后各组织细胞寒害症状越来越严重，石南藤叶片在72 h后才表现明显的受害症状，叶片厚度变化能够反映叶片受害程度。

2.3 低温胁迫对胡椒叶片SOD、CAT、POD活性的影响

4 ℃低温胁迫处理对胡椒SOD、CAT、POD活性的影响见图3。由图3可以看出，4 ℃低温胁迫后，热引1号胡椒和石南藤SOD、CAT、POD活性都有显著上升趋势。热引1号胡椒SOD活性呈现先上升后下降趋势，胁迫48 h时达到最大值，与胁迫0 h相比提高了1.01倍；石南藤SOD活性在胁迫12 h时达到最大值，与胁迫0 h相比提高了1.36倍，随胁迫时间延长呈现下降趋势，胁迫72 h时又呈现上升趋势。热引1号胡椒CAT活性

先上升后下降，胁迫24 h时达到最大值，与胁迫0 h相比提高了1.98倍；而石南藤CAT活性呈现持续显著上升趋势，胁迫72 h达到最大值，比胁迫0 h提高了2.46倍。热引1号胡椒POD活性先上升后下降，胁迫24 h时达到最大值，与胁迫0 h相比提高了5.84倍；石南藤POD活性呈现持续显著上升趋势，胁迫72 h达到最大值，比胁迫0 h提高了3.62倍。以上结果说明，与热引1号胡椒相比，4 ℃低温胁迫72 h时石南藤SOD、CAT、POD活性都呈现上升趋势，且石南藤CAT活性显著高于热引1号胡椒。

2.4 低温胁迫对胡椒叶片可溶性蛋白、可溶性糖含量影响

由图4可知，4 ℃低温胁迫后，热引1号胡椒和石南藤可溶性蛋白、可溶性糖含量随胁迫时间延长都有显著变化。热引1号胡椒可溶性蛋白含量先上升后下降趋势，胁迫48 h时达到最大值，与胁迫0 h相比提高了2.06倍；石南藤可溶性蛋白含量总体呈现上升趋势，胁迫48 h时略有下降。热引1号胡椒可溶性糖含量先上升后下降，胁迫48 h时达到最大值，与胁迫0 h相比提高了1.55

倍；石南藤可溶性蛋白含量总体呈现上升趋势，胁迫48 h时略有下降。说明低温胁迫后，热引1号胡椒可溶性蛋白和可溶性糖含量均出现不同程度的增加，提高了对膜的保护作用，但是随胁迫时间延长，可溶性蛋白和可溶性糖含量均出现下降趋势；石南藤可溶性蛋白和可溶性糖含量持续上升，对细胞膜起到了持续的保护作用。

2.5 低温胁迫对胡椒叶片丙二醛、脯氨酸含量影响

由图5可知，4 ℃低温胁迫后，热引1号胡椒和石南藤的丙二醛、脯氨酸变化差异较大。低温胁迫后，热引1号胡椒丙二醛含量先上升后下降，胁迫48 h时达到最大值，与胁迫0 h相比提高了1.47倍；石南藤的丙二醛含量呈现持续显著上升趋势，胁迫48 h时达到最大值，比胁迫0 h提高了40%，增幅显著低于热引1号胡椒。热引1号胡椒脯胺酸含量先上升后下降，胁迫48 h时达到最大值，与胁迫0 h相比提高了1.23倍；石南藤脯胺酸含量略有下降后上升。4 ℃低温胁迫后，热引1号胡椒的丙二醛、脯氨酸含量显著增加，说明其膜脂过氧化程度较高，抗寒性较弱；石南藤的丙二醛、脯氨酸含量增幅不明显，说明其膜脂过氧化程度较低，抗寒性较强。

3 讨论

低温、干旱等逆境条件下，细胞质膜透性发生变化，电解质外渗，活性氧自由基积累对植物细胞造成严重伤害，植物体内启动活性氧清除机制，保护酶活性增强，防止膜脂过氧化，增加细胞膜的稳定性，保护植物免受伤害。低温胁迫下，植物SOD活性一般先升后降，表明低温可以诱导SOD活性升高[17]。热引1号胡椒SOD活性在10 ℃、8 ℃和6 ℃处理72 h条件下呈持续上升趋势，而 4 ℃处理48 h后SOD活性才开始下降，表明4 ℃处理条件下，诱导了胡椒SOD活性升高，随胁迫时间延长，胡椒植株积累了过多的活性氧，活性氧和防御系统的动态平衡被破坏，加剧膜脂过氧 化[18-19]。与CAT和POD相比，胡椒SOD防御系统低温耐受时间更长。石南藤SOD活性表现出升-降-升的趋势，说明胁迫72 h石南藤SOD活性仍然表现活跃。4 ℃低温胁迫下，热引1号胡椒CAT和POD活性都呈现先升后降的趋势，而石南藤表现持续上升的趋势，说明随胁迫时间延长，4 ℃低温胁迫72 h热引1号胡椒保护酶系统已经被破坏，石南藤CAT和POD防御系统在此条件下还能够表现稳定，且活性持续上升。综上所述，随4 ℃胁迫时间延长，热引1号胡椒SOD、CAT和POD防御系统陆续被破坏，而石南藤的保护酶防御系统依然活跃。

可溶性糖和可溶性蛋白都是植物的渗透保护物质，在逆境条件下，通过可溶性糖和可溶性蛋白积累可以增加細胞液浓度和细胞持水力，缓解细胞质过度脱水，保护细胞质不致遇冷凝固。研究表明可溶性糖含量与植物的抗寒性呈现正相关关系[20-21]，低温胁迫下，抗寒性越强的品种可溶性糖含量增加的幅度越大，抗寒性越弱的品种可溶性糖含量增加的幅度越小[22-23]。在许多植物中，可溶性蛋白含量与抗寒性呈现正相关，可能是由于植物体内蛋白质合成增加或降解减少[21]。油棕、酿酒葡萄、油橄榄等植物的可溶性蛋白含量随胁迫温度的降低呈上升趋势，抗寒性强的品种升高的幅度大[23-25]。本试验表明，低温胁迫后胡椒的可溶性糖和可溶性蛋白都表现含量上升，随胁迫时间延长，因种质不同而表现不同的升降趋势。抗寒性强的石南藤在胁迫24 h后2种物质含量没有明显的升高，可能因为石南藤胁迫初期积累的可溶性糖和可溶性蛋白能够维持各种正常的功能和代谢；抗寒性弱的热引1号胡椒在胁迫48 h达到峰值后两种物质含量出现了剧烈下降，出现这种现象可能是低温胁迫后植物对外界不良环境做出反应，促使可溶性糖含量增加，当温度太低或胁迫时间太长时，细胞死亡，可溶性糖和可溶性蛋白含量又降低。

低温胁迫产生大量的活性氧自由基会引起膜脂过氧化，产生大量丙二醛，因此丙二醛含量成为评价生物膜受害程度的重要指标之一[26-27]。脯胺酸作为植物最有效的亲和性渗透调节物质，在逆境条件下可以增强细胞的持水力，发挥保护植物组织的作用[28]。张保青等[29]证明脯氨酸含量的增加是甘蔗对寒冷适应的重要生理反应。尽管在逆境下脯胺酸对植物具有保护作用，但其降解过程中产生的有毒物质易使植物酶活性降低或完全丧失[21， 30]。翟飞飞等[31]发现脯胺酸含量与多年生黑麦草抗寒性呈负相关，其质膜伤害越严重，脯胺酸含量越高。本研究中，从植株表型判定，石南藤抗寒性较强，热引1号胡椒抗寒性弱；4 ℃低温胁迫后，热引1号胡椒丙二醛和脯胺酸含量先上升后下降，而石南藤的丙二醛和脯胺酸含量变化不大。表明胡椒的丙二醛和脯胺酸含量与其抗寒性也呈现负相关，抗寒性强的种质丙二醛和脯胺酸含量变化不大，抗寒性弱的种质丙二醛和脯胺酸含量会显著增加。

由以上可见，低温胁迫后，胡椒的SOD、CAT和POD活性，可溶性蛋白、可溶性糖、丙二醛和脯胺酸含量都会出现显著性变化。抗寒性强的种质抗氧化酶活性能够持续增加，可溶性糖和可溶性蛋白也呈现持续上升趋势，而能对植物造成伤害的丙二醛和脯胺酸含量增幅不明显；在低温诱导条件下，抗寒性弱的种质抗氧化酶活性、可溶性糖、可溶性蛋白、丙二醛和脯胺酸含量会出现显著性增加，随胁迫时间延长，细胞死亡，代谢活动和抗氧化酶系统被破坏，出现了显著下降的趋势。本研究中抗氧化酶活性和渗透物质含量变化规律为胡椒抗寒分子代谢途径相关基因研究提供依据，并为胡椒开展抗寒育种工作和抗寒分子机理研究提供材料基础。

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