苦瓜枯萎病抗性材料Thai4—6的遗传模型分析

刘子记　朱婕　牛玉　杨衍

摘 要 苦瓜枯萎病是尖孢镰刀菌苦瓜专化型引起的真菌病害，探明苦瓜枯萎病的抗性遗传机制对制定抗病育种策略具有现实指导意义。本文以抗枯萎病苦瓜材料Thai4-6和感病材料CN19-1为亲本配制杂交组合，基于该组合6世代遗传群体（P1、P2、F1、F2、BCP1和BCP2），采用主基因+多基因混合遗传模型分析枯萎病抗性遗传特性。数据分析结果表明，该杂交组合的枯萎病抗性呈连续分布，最适模型为2对加性-显性-上位性主基因+加性-显性多基因遗传模型（E-1），2对主基因加性效应值均为–13.85，显性效应值分别是25.58和34.26，主基因遗传率在BCP1、BCP2和F2中分别是86.03%、80.34%和94.25%，表明该组合枯萎病抗性主要受2对主基因控制。环境因素引起的变异在3个分离世代群体中分别占13.97%、14.06%和5.75%。本研究可为抗枯萎病苦瓜育种提供理论依据。

关键词 苦瓜；混合遗传模型；枯萎病抗性；遗传分析

中图分类号 S642.5 文献标识码 A

Abstract Bitter gourd wilt is a fungus disease caused by Fusarium oxyspoorum Schl. f. sp. momodicae Sun & Huang. Exploring resistance mechanism has practical guiding significance for wilt resistance breeding of bitter gourd. Crosses had been made between bitter gourd line Thai4-6， high resistant to fusarium wilt and CN19-1， high susceptible to fusarium wilt. The inheritance of fusarium wilt resistance was analyzed with P1， P2， F1， BCP1， BCP2 and F2 populations through employing the major gene plus polygene mixed inheritance model. The results showed that the wilt resistance in the populations of F2， BCP1， and BCP2 was a continuous distribution. The most suitable model was E-1 model， two major genes with additive-dominance-epistasis effects plus polygenes with additive-dominance effects. The additive effect of the 2 major genes was –13.85 and the dominance effect was 25.58 and 34.26， respectively. The heritability value of the major genes in BCP1， BCP2， and F2 was 86.03%， 80.34% and 94.25%， respectively. The results showed that the wilt resistance was mainly controlled by 2 major genes. The environmental variation in BCP1， BCP2， and F2 accounted for 13.97%， 14.06% and 5.75%， respectively. This study could provide a theoretical basis for the wilt resistance breeding of bitter gourd.

Keywords bitter gourd； wilt resistance； mixed genetic model； genetic analysis

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.08.005

苦瓜（Momordica charantia L.， 2n=2x=22）起源于非洲地区，在美洲及亚洲，尤其南亚和东南亚地区有着悠久的种植历史[1-2]。苦瓜营养价值很高，富含多种营养物质。此外，苦瓜所含的药理活性成分具有抗肿瘤细胞增殖[3]、降低血糖水 平[4]、消炎[5]和提高人体免疫力[6]等功效。苦瓜是海南省冬季“南菜北运”的一种主要瓜菜，为丰富全国人民的“菜篮子”提供了有力保障。

苦瓜枯萎病由尖孢镰刀菌苦瓜专化型（Fusarium oxyspoorum Schl. f. sp. momodicae Sun & Huang）引起，是对苦瓜生产危害最为严重的一种土传真菌性病害[7]，严重影响苦瓜的产量和品质[8]。近年来，随着重茬种植面积不断扩大，苦瓜枯萎病的危害日益严重，已成为苦瓜安全生产的限制性因素。如何有效地防治苦瓜枯萎病是生产上迫切需要解决的关键问题。与其他防治措施相比，选育和推广抗病品种是防治苦瓜枯萎病最为经济和有效的措施，对于促进苦瓜生产的可持续发展具有重要意义。有关苦瓜抗枯萎病种质筛选的研究已有一些报道，朱天圣等[9]、郭堂勛等[10]、罗方芳等[11]、曾华兰等[12]分别对苦瓜主栽品种及种质资源进行枯萎病抗性鉴定，鉴定结果并未发现高抗枯萎病的苦瓜材料。陈振东等[13]鉴定了143份苦瓜种质资源对枯萎病的抗性，仅发现1份高抗级别的材料，未发现对枯萎病表现免疫的材料。了解枯萎病抗性的遗传规律，可为抗病品种选育提供参考，加速育种进程。

抗病性大部分属于数量性状，遗传规律比较复杂，常因研究材料不同具有不同的遗传模式，可由主基因组成、微效多基因组成、也可以由主基因与微效多基因共同组成。瓜类作物枯萎病抗性遗传呈现多样化的特点。在西瓜中有显性单基因和多基因控制枯萎病抗性的报道[14-15]，黄瓜对枯萎病的抗性有显性单基因、部分隐性基因和多基因控制的报道[16-17]。近年来主基因+多基因混合遗传模型多世代联合分析方法已广泛应用于不 同植物数量性状的遗传分析[18]，如小麦线虫抗 性[19]，水稻稻曲病和条叶枯病抗性[20-21]、甘蓝型油菜角果长度[22]、樱桃番茄的果形[23]、花生产 量[24]、棉花的耐低温[25]、黄瓜种子休眠[26]等性状。赵秀娟等[27]以苦瓜抗病亲本‘0417和感病亲本‘472113为材料，采用卡方检验分析了苦瓜对枯萎病抗性的遗传规律，结果表明显性单基因控制苦瓜对枯萎病的抗性。苦瓜对枯萎病抗性的遗传研究至今报道较少，因此开展苦瓜枯萎病抗性遗传规律研究，可以为苦瓜抗枯萎病育种提供参考。本研究拟采用苦瓜高抗枯萎病材料‘Thai4-6和高感枯萎病材料‘CN19-1配制杂交组合，利用亲本P1、亲本P2、F1、BCP1、BCP2和F2分离群体，基于主基因+多基因混合遗传模型多世代联合分析方法，解析苦瓜枯萎病抗性遗传规律。

1 材料与方法

1.1 材料

亲本材料为Thai4-6（P1）和CN19-1（P2）。Thai4-6是由泰国引进对苦瓜枯萎病菌表现高度抗病，生长势较强，晚熟。CN19-1是由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所选育的高代自交系，对苦瓜枯萎病菌表现高度感病，早熟。

2016年春，在中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所蔬菜实验基地种植亲本材料Thai4-6（P1）和CN19-1（P2），配制杂交组合获得F1（Thai4-6CN19-1）种子。2016年秋F1自交获得F2分离群体，并配制BCP1（F1Thai4-6）和BCP2（F1CN19-1）群体。共获得了6个世代（P1、P2、F1、F2、BCP1和BCP2）种子。2017年春对F2、BCP1和BCP2单株进行自交获得每个单株家系的种子。

1.2 方法

1.2.1 苦瓜枯萎病菌孢子悬浮液的制备 苦瓜枯萎病株收集自海南省屯昌县苦瓜主栽区，采用组织分离法进行病原菌分离，通过培养物形态特征及分子水平鉴定、致病性及寄主专化型测定，结果表明，分离物属于尖孢镰刀菌苦瓜专化型[28]。取苦瓜枯萎病菌丝接种于PDA液体培养基中，于25 ℃黑暗条件下震荡培养7 d。采用纱布过滤去掉菌丝，滤液以4 000 r/min离心3 min，倒掉上清液，利用无菌水洗出沉淀的孢子。孢子的浓度采用血球计数器进行计算，接种用孢子浓度为1106 CFU/mL。

1.2.2 抗病性鉴定 2017年5月，在中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所蔬菜实验基地温室内进行抗病性鉴定，先用55 ℃温水浸泡苦瓜种子10 min，经过浸种8 h、于30 ℃温箱中催芽24 h后播于预先灭菌的培养土中。P1种植120株，P2种植125株，F1种植150株，每5株为1重复。F2、BCP1、BCP2每个单株家系种植20株。待幼苗长至2～3 片真叶时，自营养钵内小心挖出植株，经清水洗净后，采用浸根法进行接种[13]，将苦瓜幼苗根部置于孢子悬浮液中浸泡30 min，然后移栽到营养钵中，按照常规措施进行管理。接种15 d后开始调查发病情况，参照周凯南等[29]的方法，将植株病情分为5级，0级：无明显症

状；Ⅰ级：子叶明显变黄；Ⅱ级：子叶变黄并逐渐萎蔫，维管束轻度变色；Ⅲ级：子叶枯死，维管束变成浅褐色，真叶开始发黄；Ⅳ级：维管束变成褐色，整株萎蔫并最终枯死。病情指数=100× Σ（各级病株数×各级代表值）/（调查总株数×最高级代表值）。其中病情指数0～15为高度抗病类型（HR），15～30为抗病类型（R），30～50为中度抗病类型（MR），50～70为感病类型（S），70～100为高度感病类型（HS）。

1.3 数据分析

采用主基因+多基因混合遗传模型多世代联合分析方法[18， 30]，对苦瓜枯萎病抗性遗传特性进行分析，根据AIC值最小准则选择遗传模型及备选模型，通过U12、U22、U32、nW 2和Dn进行适合性检验，根据结果选择最佳遗传模型。各基因的效应值、方差和遗传率等遗传参数采用最小二乘法进行估计。采用SAS 9.0软件计算平均数和多重比较。

2 结果与分析

2.1 表型数据分析

比较亲本和F1群体病情指数数据表明，Thai4-6（P1）和CN19-1（P2）的病情指数分别为22.29和86.22，亲本间差异达到显著水平（p< 0.05），杂交种F1的病情指数为33.56，介于双亲

之间，与双亲的差异达显著水平（p<0.05）（表1）。将3个世代群体（BCP1、BCP2和F2）病情指数分组，统计其分布频次，结果表明，该组合枯萎病抗性病情指数呈连续性分布，具有广泛的遗传变异和数量性状遗传特征。另外，B1、B2、F2病情指数次数均呈多峰分布，其中BCP1有2个峰，BCP2有3个峰，F2有3个峰（表2），表明苦瓜枯萎病抗性遗传符合主基因+多基因的遗传特征。

2.2 枯萎病抗性的遗传模型分析

采用主基因+多基因混合遗传模型对Thai4- 6×CN19-1组合6世代（P1、P2、F1、BCP1、BCP2和F2）枯萎病抗性進行联合分析，A类（1对主基因）、B类（2对主基因）、C类（多基因）、D类（1对主基因+多基因）、E类（2对主基因+多基因）共5类24种遗传模型的AIC值通过ECM算法计算获得（表3），根据AIC值最小选择准则，E-1模型的AIC值最小，D-0和B-1模型的AIC值与E-1模型比较接近，可作为遗传分析的备选模型。

对E-1、D-0和B-1模型进行一组适合性检验（U12、U22、U32、nW2和Dn），检验结果显示，E-1模型达到显著水平（p<0.05）的检验统计量为0个，B-1模型达到显著水平（p<0.05）的检验统计量为0个，D-0模型达到显著水平（p<0.05）检验统计量为1个，根据达到显著水平统计量最少的原则和AIC值最小准则，适于苦瓜枯萎病抗性遗传分析的模型为E-1（MX2-ADI-AD，2对加性-显性-上位性主基因+加性-显性多基因混合遗传模型）（表4）。

2.3 一阶、二阶遗传参数估算

根据最优遗传模型估算苦瓜枯萎病抗性遗传的一阶、二阶遗传参数。影响枯萎病抗性的2对主基因加性效应值相等，为–13.85；2对主基因的显性效应值（ha和hb）分别为25.58和34.26。2对主基因的加性效应互作（i）为16.30，显性效应间互作（I）为–57.71，加性和显性效应之间的互作（jab和jba）分别为–6.41和19.34，该结果表明2对主基因之间的互作可能对枯萎病抗性影响较大。2对主基因的显性度分别为–1.85和–2.47，说明2对主基因为超显性（表5）。BCP1、BCP2和F2分离世代群体遗传率分别为86.03%、85.94%和94.25%。BCP1、BCP2和F2 3个分离世代群体主基因遗传率分别为86.03%、80.34%和94.25%，分别占总遗传率的100%、93%和100%，多基因遗传率分别为0、5.60%和0，该结果表明2对主基因主要控制苦瓜枯萎病抗性。环境因素引起的变异在3个分离世代群体中分别占13.97%、14.06%和5.75%（表6）。

3 讨论

明确枯萎病抗性的遗传规律，选育和推广抗性品种是防治苦瓜枯萎病最为有效的措施。以往研究多通过人为确定抗病和感病标准，然后对试验群体进行卡方测验研究抗性遗传规律。人为划分抗、感標准带有主观性，很难准确判断处于抗感分界附近的材料是抗病还是感病[20]。本研究以抗枯萎病苦瓜材料Thai4-6和感病材料CN19-1为亲本配制杂交组合，构建了6世代遗传群体（P1、P2、F1、BCP1、BCP2和F2），从3个世代分离群体（BCP1、BCP2和F2）的频次分布来看，枯萎病抗性表现为连续分布，呈现数量性状的遗传特征，因此本研究采用适于数量性状遗传分析的主基因+多基因混合遗传模型，鉴于不同分离世代的整体信息确定最佳遗传模型，从而避免了人为抗感分级引起的误差。另外，该方法除了估计主基因遗传效应外，还可以检测出基因间的互作效应及多基因效应，进一步丰富了遗传信息。

本研究采用主基因+多基因混合遗传模型分析了苦瓜对枯萎病抗性的遗传特性，符合2对加性-显性-上位性主基因+加性-显性多基因混合遗传模型。本研究结果与赵秀娟等[27]的研究结果不太一致，除了与所选用的抗原材料遗传背景、病原菌优势生理小种不同有关，还有可能因所用的遗传分析方法不同所致。

本研究结果表明，Thai4-6×CN19-1组合对枯萎病抗性的遗传由2对主基因和多基因控制，2对主基因间存在加性、显性、加加互作、加显互作、显加互作、显显互作作用，多基因间存在加性和显性作用，因此，适宜的杂交组合可以获得强杂种优势。苦瓜对枯萎病的抗性主要受主基因控制，主基因遗传率在BCP1、BCP2和F2中分别是86.03%、80.34%和94.25%，为了防止抗性基因在世代传递过程中效应减退或丢失，可以在育种的早期世代进行选择，获得稳定的抗病骨干材料。在BCP2回交世代中多基因遗传率占有一定比例，为5.60%，BCP1和F2代无多基因遗传率。环境条件变异也对枯萎病抗性产生了部分影响，3个分离世代群体环境因素引起的变异分别占13.97%、14.06%和5.75%。该结果表明回交群体受环境因素的影响较大。

本研究初步揭示了苦瓜对枯萎病抗性的遗传特性，为苦瓜抗病育种提供了新的理论依据。在未来的研究中将会对Thai4-6×CN19-1 F2群体中控制枯萎病抗性的基因进行数量性状位点定位，鉴定与主效抗性基因紧密连锁的标记，通过分子标记辅助选择技术培育抗病品种。另外一方面对抗病基因进行精细定位与克隆，进一步从分子水平上阐明苦瓜对枯萎病抗性遗传的分子基础。

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