贵州小白及内生真菌对块茎腐烂病拮抗作用研究

曾茜 陈旭 刘璞玉 杨仁德 朱森林 杜慕云

摘 要 植物内生真菌作为获取生物防治材料的一个潜在且庞大的优质资源库，极具开发应用潜力。采用平板对峙法，对已有的137株小白及内生真菌进行块茎腐烂病菌菌丝生长的拮抗活性筛选，并以6种常见农业病原菌作为靶标菌完成抗菌谱测定，初步获得抗病能力较强的2株内生真菌：菌株GZFJ021和GZLG033。

关键词 小白及；内生真菌；块茎腐烂病；拮抗作用

中图分类号：Q939.96 文献标志码：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.1.002

白及又名箬兰、连及草和甘根等，隶属于单子叶植物纲兰科白及属，为多年生草本植物。以干燥块茎入药，形状不规则，多有数个爪状分枝，质地坚硬，柔韧性好。其性微寒，味苦，归肺、胃、肝经，具有收敛止血、消肿生肌的作用，常用于治疗咯血、外伤出血、疮疡肿毒、皮肤皲裂等病症[1]。白及作为贵州省珍贵的中药材品种之一，不仅具有独特的药用和观赏价值，还被广泛应用于食品、化工等领域，可开发利用的潜力巨大[2-3]。据报道，目前共发现4种白及属植物分布在我国境内，其中贵州有3种（白及、黄花白及和小白及），以小白及野生资源较为珍稀[4]。

近年来，随着白及人工种植规模扩大和连续种植，加上生态环境变化等因素的影响，导致病虫害频频发生，尤其在高温高湿条件下，白及易受病原微生物的侵染而出现根腐病、叶褐斑病、灰霉病等[5]。白及作为贵州省道地药材，市场需求量巨大，但由于病虫害的影响，特别是块茎腐烂病危害最为严重，使得产量和品质有所下降，制约了白及产业的健康可持续发展。长期的栽培实践表明，农药防治白及块茎腐烂病效果不理想，并且对环境和产品质量安全均存在较大影响。笔者以前期分离获得的137株小白及内生真菌作为供试菌株，块茎腐烂病病原菌立枯丝核菌QX1、尖孢镰刀菌ZF1和ZF2作为靶标菌，通过平板对峙法筛选抗病活性菌株，旨在为探索高效的生物防治技术奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

1）供试目标菌：已分离获得的137株小白及植物内生真菌。

2）供试病原菌：白及块茎腐烂病病原菌立枯丝核菌（Rhizoctonia solani，QX1）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum，ZF1、ZF2）。

供试目标菌、供试病原菌均保存于贵阳中医学院基础医学院微生物实验室。

1.2 主要培养基和仪器

1）培养基：为PDA培养基，使用马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15 g，加水至1 000 mL，pH值自然。

2）仪器：超净工作台、恒温生化培养箱等。

1.3 试验方法

1）病原拮抗菌筛选：采用平板对峙法对已有的内生真菌进行拮抗菌筛选试验。在无菌条件下利用打孔器取直径7 mm供试病原菌菌饼接种于PDA平板中央，置于26 ℃恒温培养48 h后，于左右两边距离菌落边缘2 cm处接入内生真菌菌饼，无菌面朝上；同样在上下两面接入无菌PDA培养基饼作为空白对照，继续恒温培养3～5 d后测量抑菌带大小。设3次重复，取平均值。

2）拮抗菌抗菌谱测定：同样采用平板对峙法，利用试验1）中获得的拮抗菌作为目标菌，选择常见的6种作物病原菌进行抗菌谱测定，分别为番茄早疫病菌F588、番茄黑斑病菌F788、水稻纹枯病菌WB、小麦赤霉病菌CM、水稻稻瘟病菌DWB和烟草黑胫病菌HJB。试验方法同上。

3）数据统计与分析：采用SPSS软件对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 病原拮抗菌筛选

采用平板对峙法对137株小白及内生真菌抗病活性进行初筛。结果共筛选出5株内生真菌，菌株GZYS007、GZFJ021、GZFJ028、GZLG033、GZLG25对白及块茎腐烂病病原菌立枯丝核菌QX1、尖孢镰刀菌ZF1和ZF2的菌丝生长表现出较强抑制活性（见表1）。其中，对立枯丝核菌QX1产生的抑菌带从大到小依次为：GZYS007（11.50）>GZFJ021（10.75）>GZLG033（9.75）>GZLG25（8.50）>GZFJ028（4.50）；对尖孢镰刀菌ZF1，ZF2则分别为：GZFJ021（13.00）>GZLG033（11.00）>GZFJ028（6.75），GZFJ021（11.25）>GZLG033（10.25）>GZFJ028（9.50）>GZLG25（3.75）。綜合分析认为，菌株GZFJ021、GZLG033和GZFJ028的抑制效果最好，可作为下一步抗菌谱筛选试验的目标菌株。

2.2 拮抗菌抗菌谱测定

采用相同方法对3株活性较好的白及块茎腐烂病拮抗菌进行抗菌谱测定试验，结果显示，3株内生真菌GZFJ021、GZFJ028、GZLG033对常见农业病原菌小麦赤霉病菌、水稻纹枯病菌、马铃薯晚疫病菌、烟草黑胫病菌、玉米灰斑病菌和高粱炭疽病菌能产生较强的生长抑制效果（见表2）。其中，菌株GZFJ021对6种病原菌均具有一定抑制活性，从大到小依次为：烟草黑胫病菌（14.50）>小麦赤霉病菌（14.00）>水稻纹枯病菌（12.75）>高粱炭疽病菌（10.25）>马铃薯晚疫病菌（6.25）>玉米灰斑病菌（5.50）；菌株GZLG033次之，对水稻纹枯病菌和玉米灰斑病菌抑制效果较强，分别为14.25和12.75；菌株GZFJ028相对较差，能对烟草黑胫病菌菌丝生长产生大小为11.25的抑菌带。因此，内生真菌GZFJ021和GZLG033表现出较广的抗菌谱，且活性也较强，可作为生防菌资源储备。

3 讨论与展望

植物内生真菌一般是指那些部分或整个生活史存在于健康植物组织和器官中，而不会对宿主产生侵染现象或明显病害症状的一类真菌。它们能通过调控植物生理代谢来增强寄主在环境中的抗逆性、适应性等[6]。植物内生真菌丰富的生物多样性造就了次生代谢产物的多样性，其效用活性涵盖了医药、农业及工业生产等多个领域。特别是生长于生态系统复杂多样环境中的植物，其内生真菌产生活性物质的可能性更大，且效用更强[7]。

生物防治作为化学药剂理想的替代方法，具有安全、生态、特异性强等优势，主要是利用有益或功能性生物及其代谢产物来控制有害生物种群的发生，减少危害。本研究初步筛选出2株具有白及块茎腐烂病拮抗活性的内生真菌，表现为抗菌谱广、效用强，可为中药材人工种植病害生防技术的开发提供材料基础。

参考文献：

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2015.

[2] 徐中志，谭敬菊，陈翠，等.不同白及种源分析评价与利用研究[J].江西农业学报，2011，23（1）：90-92.

[3] 何海玲，顾龚平，张卫明.白及多糖胶涂膜保鲜樱桃番茄的研究[J].食品科学，2007，28（4）：336-340.

[4] 和志娇，吕丽芬，杨丽云，等.白及种质资源遗传多样性的ISSR分析[J].西南农业学报，2008，21（4）：1081-1085.

[5] 曾令祥，杨琳，陈娅娅，等.贵州中药材白及病虫害种类的调查与综合防治[J].贵州农业科学，2012，40（7）：106-108.

[6] Tetard C， Edwards R， Catherine TJ， et al. Potential roles for microbial endophytes in herbicide tolerance in plants[J]. Pest Manag Sci， 2016， 72（2）： 203-209.

[7] 陈旭，曾茜，刘璞玉，等.贵州小白及内生真菌多样性与产抗病活性物质菌株的筛选[J].西南农业学报，2017，30（1）：111-117.

（责任编辑：丁志祥）