基于原球茎培养的白芨育苗技术研究

江本利，於春，王红娟，朱加保，路献勇，胡积送，闫晓明

摘要 [目的]研究白芨原球莖增殖液体培养及原球茎直播育苗技术。[方法]通过正交试验筛选MS培养基浓度、马铃薯汁浓度及KT浓度，对原球茎增殖液体培养进行研究；通过单因素试验筛选原球茎直播育苗的播种基质。[结果]白芨原球茎增殖液体培养各因素的优势组合为MS + KT 1.0 mg/L +马铃薯汁120 g/L；白芨原球茎直播有比较优势的基质为腐殖土50%+碎木屑50%+NAA 0.5 mg/L +香蕉汁100 g/L。[结论]白芨原球茎增殖液体培养及原球茎播种育苗的技术路线在生产上具有可行性，该方法简化了培养程序。

关键词 原球茎； 增殖； 育苗

中图分类号 S567.23 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）06-0039-04

Study on Seeding Technique of Bletilla striata Based on Protocorm Cultivation

JIANG Benli，YU Chun，WANG Hongjuan et al （Cotton Research Institute，Anhui Academy of Agricultural Sciences，Hefei，Anhui 230031）

Abstract [Objective] To study the Bletilla striata protocorm liquid cultivation and protocorm direct seeding technique.[Method] Orthogonal test was used to screen the concentrations of MS medium，potato juice and KT，so as to study the protocorm liquid proliferation cultivation.Single factor test was used to screen the seeding mediumn of protocorm.[Result] The most suitable factor combination for Bletilla striata protocorm liquid culture was MS + KT 1.0 mg/L + potato juice 120 g/L，and the most suitable matrix for Bletilla striata seeding was humus soil 50% + scraps of wood 50%+NAA 0.5 mg/L + banana juice 100.0 g/L.[Conclusion] The technology route of Bletilla striata protocorm liquid cultivation and protocorm seedlingraising was feasible in production，which simplified the cultivation procedure.

Key words Protocorm；Proliferation；Seedling cultivation

白芨（Bletilla striata）是兰科白芨属植物，多年生草本，其干燥假鳞茎为我国民间传统中药材[1]，具有极高的药用价值，其味苦、甘、涩，性凉，归肺、胃、肝经，具有收敛止血、消肿生肌的功能，主治肺胃出血、外伤出血、痈肿疮疡、皮肤皲裂、水火烫伤等[2-4]。近年来，随着医药、化工技术水平及生活质量的提高，白芨在医药工业、化妆品工业、观赏园艺等领域的应用迅速扩大[5]，导致需求激增，而大量的白芨原料供给只能通过人工栽培获得。

成熟的育苗技术是白芨人工栽培必不可少的支撑条件。然而白芨分株移栽，繁殖系数太小；白芨种子非常细小且无胚乳，在自然条件下萌发困难，繁殖效率低。白芨的繁育特性抬高了批量育苗的技术门槛。近年来，各种组织培养技术被应用于白芨快速繁育研究，在促使白芨种子萌发、细胞诱导、芽根分化等方面取得了较大进展[6-9]，形成了无菌萌发→瓶苗培育（壮苗增殖、芽诱导、根诱导）→炼苗移栽为主要路线的育苗模式，初步实现了批量育苗。但因为瓶苗转接较多、操作繁琐、无菌保持及褐化控制等技术要求高，所以育苗成本很高。为了最大限度地降低人工及环境控制成本，笔者在前人研究的基础上，提出以原球茎诱导和增殖培养为重点，探索原球茎直播方法，从而简化白芨繁育流程，完善育苗技术。

1 材料与方法

1.1 试验材料 供试白芨蒴果采自安徽省农业科学院棉花研究所安庆基地种质资源圃，胚龄（从开花开始计算）达20周，未开裂，果荚饱满，外表无霉变，颜色为黄绿色与褐色相间，4 ℃冷藏放置。

取白芨成熟未开裂蒴果，用自来水洗净，经洗衣粉水浸泡 20 min，自来水反复冲洗，用卫生纸吸干水分，置超净工作台上，用75%酒精浸泡的棉球擦表皮2次，然后用0.1%的升汞浸泡10 min，依次用无菌水反复冲洗5次，然后用已灭菌的滤纸吸干表面的水分。在无菌条件下，用解剖刀切开蒴果，将种子用0.09%的无菌琼脂水混悬，形成均匀一致的种子悬液，种子浓度定量按蒴果4个/L配制。借鉴鲁光耀等[10]、张宇思等[11]研究结果，采用液体培养法，用移液枪吸取种子悬液，播于1/2MS + 100g/L 马铃薯汁 +20 g/L 蔗糖，pH 5.8的液体培养基中，22 ℃，100 r/min，光照12 h/d培养。7～10 d可见种子吸水膨胀，经30 d培养种子由原来的黄褐色变成淡绿色，继而成为小球体状（即原球茎）。此时的原球茎即为试验研究的无菌材料。

1.2 试验方法 试验过程分为2个阶段，第一阶段原球茎增殖培养、壮苗培养，第二阶段原球茎播种。具体步骤如下：

1.2.1 原球茎增殖液体培养。以培养基浓度类别、有机物添加剂马铃薯汁浓度、细胞分裂素KT浓度为因素，每因素3水平，设计L9（3）3正交试验（表1）。将预先培养的原球茎（黏连在一起的原球茎切开）按100粒/处理准备9个处理，在超净台上用无菌吸水纸吸至恒重，称量并记录鲜重G1，接种于液体培养基。其他培养条件如下：NAA 0.1 mg/L，AC 0.5 g/L，蔗糖30 g/L，pH 5.8～6.0，121 ℃灭菌20 min，光照度为 2 500 lx，光照时间为 12 h/d，100 r/min进行培养，每处理3次重复。30 d 后统计原球茎生长数据，统计增殖后原球茎数量、称量各处理原球茎总鲜重G2，计算增重率（G2-G1）/G1×100%；每处理随机选取 50 粒原球茎，利用游标卡尺测量原球茎的粒径，并对原球茎的其他直观生长状况进行描述。

1.2.2 原球茎固体壮苗培养。将各配方培养所得的原球茎转移到MS + 蔗糖30 g/L固体培养基培养，pH 5.8，温度22 ℃，相对湿度 55%～75%，光照度 2 500 lx，光照周期为 10 h/d，进行壮苗培养。

1.2.3 原球茎播种。采用3种播种基质，分别为：A： 腐殖土+NAA 0.5 mg/L浇灌；B：腐殖土50%+碎木屑50%+NAA 0.5 mg/L浇灌；C：腐殖土50%+碎木屑50%+NAA 0.5 mg/L浇灌+ 10%浓度香蕉汁浇灌。将基质湿热灭菌，装于105孔穴盘；经壮苗培养15 d的原球茎开盖炼苗3 d后，取出原球茎，洗净黏附基质，随机播于穴盘中，100颗/穴盘，每处理3次重复；置于温度 25 ℃，相对湿度 55%～75%，光照度 2 500～3 000 lx，光照周期10 h/d的温室培养。30 d后统计生长情况。

1.3 数据统计与分析 用Excel 软件进行数据处理，采用 SPSS 19.0进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 因素对原球茎增殖的影响 从图 1 可以看出，接种后经增殖培养30 d，原球茎实现了增殖，新增原球茎不同程度丛生黏连，颜色从白色到浅绿、深绿不一。根据表2正交试验方案结果可知，2号、3号及9号处理原球茎数量增加较多，7号、1號处理原球茎数量增加较少；9号、8号处理原球茎增重较多，1号、4号及7号处理增重较少；9号、3号处理原球茎粒径较大，1号、8号、7号处理粒径较小。综合来看，9号处理在增殖及生长方面都有优势。

极差分析结果（表3）显示，各因素对原球茎数量增加的影响程度由高到低依次为马铃薯汁浓度、KT浓度、培养基浓度；各因素对原球茎增重率的影响程度由高到低依次为马铃薯汁浓度、培养基浓度、KT浓度；各因素对增殖培养中原球茎粒径的影响程度由高到依次为马铃薯汁浓度、KT浓度、培养基浓度。

对3个统计指标作进一步方差分析可知，马铃薯汁浓度对原球茎数量增加、增重及粒径大小的影响均达到显著水平（P<0.05） ，KT浓度对原球茎数量增加、粒径大小的影响均达到显著水平（P<0.05），与极差分析结果一致。

综上所述，该试验中马铃薯汁浓度对原球茎增殖影响最大，KT浓度主要影响数量增加，MS对原球茎增殖培养影响较小。白芨原球茎增殖液体培养可在处理9的因素组合下进行，即MS + NAA 0.1 mg/L + KT 1.0 mg/L +马铃薯汁120 g/L +AC 0.5 g/L+蔗糖30 g/L，pH 5.8～6.0，121 ℃下灭菌20 min，光照度为 2 500 lx，光照时间 12 h/d，100 r/min 。

2.2 播种基质对出苗的影响 由表4可知，原球茎播种1个月后可以实现育苗，3 种基质上播种出苗情况差异达极显著水平，基质C出苗率极显著优于基质A，基质C、B生根率极显著优于基质A。苗情生长如图1所示，基质C上的幼苗叶片颜色、厚度均优于基质B，而基质B优于基质A。

3 讨论

白芨种子萌发成苗期间，原球茎是形态发育的典型阶段，此阶段白芨可向根芽分化方向生长、也可向原球茎自身增殖方向生长[12-13]。据此特点，在种子萌发诱导原球茎的成熟技术基础上，笔者研究了原球茎增殖与播种技术，探讨原球茎作为白芨“种子”播种育苗的可行性。

研究结果显示，各浓度的液体MS培养基都能支持白芨原球茎的增殖生长，但相互之间差异并不显著，与张宇思等[11]研究结果不同。这可能是因为马铃薯汁有机营养充足，致使培养基的作用弱化，需要进一步验证试验。 研究结果还显示，适宜浓度的有机添加物马铃薯汁与KT在原球茎增殖生长中具有重要作用。马铃薯汁浓度高，则增殖生长较旺盛，这可能与复合营养供给充足、有利于增殖生长的各因素比例适当、符合生长需求、协同效应好有关；1.5 mg/L KT浓度的原球茎数量与质量增长弱于1.0 mg/L KT，可能出现了类似于固体培养时发生的玻璃体现象，抑制了原球茎生长。原球茎播种试验显示，增强通透性（添加木屑）和浇灌有机质有利于播种成苗，这可能是因为较好的通透性与香蕉汁均有利于生根，这与袁宁[14]的研究结果一致。

4 结论

该研究通过液体培养方式对白芨原球茎增殖培养的 3个影响因素进行了研究，结果表明MS + NAA 0.1 mg/L + KT 1.0 mg/L + 马铃薯汁120 g/L +AC 0.5/L+蔗糖30 g/L，pH 5.8～6.0，121 ℃下灭菌20 min，光照度为 2 500 lx，光照时间 12 h/d，100 r/min条件下进行原球茎液体培养可较好的实现增殖。单因素原球茎直播育苗试验结果显示，基质C，即腐殖土50%+碎木屑50%+NAA 0.5 mg/L浇灌+ 10%浓度香蕉汁浇灌育苗效果较好。

白芨原球茎增殖液体培养及原球茎播种育苗的技术路线生产上具有可行性，培养程序及操作较传统组培育苗相对简化，降低了育苗成本。但影响白芨原球茎诱导、增殖及进一步分化成苗的因素较多[15]，如培养基配方、激素配比、碳氮比例调节、pH调节、污染控制、玻璃化、褐化控制以及培养温度、光照、培养方式（固体或液体）等都会影响育苗，仅几次简单试验无法探讨清楚，因此原球茎播种育苗技术仍需进一步研究。

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