白及总酚闪式提取工艺研究及含量测定

彭焱 唐克华

摘要 [目的]优化白及块茎中总酚的闪式提取工藝，并比较不同样地人工栽培白及新生茎总酚含量。[方法]在单因素试验基础上，采用L9（34）正交试验优化闪式提取条件，Folin-酚比色法测定总酚含量。[结果]白及总酚闪式提取最佳条件：料液比1∶40、乙醇体积分数55%、提取电压160 V、提取时间100 s;5个样地的7份栽培白及新生茎，总酚含量最低的为0.10%，最高的为0.67%。[结论]闪式提取法能满足白及总酚迅速提取的要求;不同栽培品种的白及新生茎总酚含量差异较大，这对于白及品质评价具有一定的参考价值。

关键词 白及;新生茎;总酚;闪式提取;含量测定

中图分类号 S567.239;R284.2文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）33-0157-04

白及[Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.]为兰科白及属多年生草本植物，以其干燥块茎入药，药用历史悠久，主要药用于机体的肺、胃、肝等经脉脏腑病症，如吐血、咯血、外伤出血、烧烫伤、皮肤皲裂等[1]。白及鲜品色白，是传统的美容药材，药效温和且无不良反应，常作为功能日化产品原料，如白及牙膏，用于咽喉红肿热痛、口腔溃烂、牙龈炎等口腔和牙科疾病的辅助治疗[2]。白及目前在保健、美容日化等方面的应用越来越广泛[3]。研究表明，白及含有黏胶质（白及多糖）、淀粉、联苄类、菲类及其衍生物、花色素苷类、黄酮类、多酚类、氨基酸及少量的挥发油等生物活性物质[4]，具有抗胃溃疡、抗氧化、抗菌抗炎、调节免疫力、抗肿瘤等[5-6]生理作用。植物酚类化合物主要分为类黄酮、酚酸和单宁三类。常见的植物酚酸有绿原酸（chlorogenic acid）、原儿茶酸（protocatechuic acid）、没食子酸（gallic acid）和咖啡酸（caffeic acid）等，植物酚酸有较强的抗氧化、抗菌、抗肿瘤活性，被广泛应用于保健食品、化妆品等[7]。杨毅等[8]从白及块茎中分离得到4种多酚类物质，可见白及中含有多种多酚类物质，如能作为新的植物多酚资源开发，这对白及的深加工有重要意义。植物中酚酸种类及含量受多因素影响，如植物成熟期、种植方式及加工条件等[9]。闪式提取器是根据组织破碎原理而设计的一种新型提取器，具有室温提取、无成分破坏、操作简单快速、高效节能等优点[10]，现已广泛应用于植物成分的提取。目前，关于白及总酚提取测定的研究报道还较少，笔者以白及干粉为原料，研究其总酚的闪式提取工艺，并对采自武陵山区5个样地的7份栽培白及新生茎部位的总酚含量进行了提取和测定。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器。

闪式提取器（型号JHBE-20A，河南智晶生物科技发展有限公司）;高速多功能粉碎机（型号150T，永康市铂欧五金制品有限公司）;电子分析天平（型号AL204，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）;紫外分光光度计（型号Evolution 220型，赛默飞世尔科技（中国）有限公司）;台式低速离心机（型号TDL-40B，上海安亭科学仪器厂）;台式高速冷冻离心机（型号TGL20M，湖南凯达科学仪器有限公司）;数显恒温水浴锅（型号HH-S4，江苏金城国胜试验仪器厂）;红外水分快速测定仪（型号HB43-S，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）;数显鼓风干燥箱（型号GZX-9146 MBE，上海博迅实业有限公司医疗设备厂）。

1.1.2 试剂。无水乙醇、95%乙醇（AR），天津市北辰方正试剂厂;甲醇（AR），天津市大茂化学试剂厂;盐酸（AR），株洲市星空化玻有限责任公司;Folin酚（AR，C=1.00 mol/L），上海金穗生物科技有限公司;无水碳酸钠（AR），天津市大茂化学试剂厂;没食子酸标准品（纯度>99%），张家界久瑞生物科技有限公司。

1.1.3 试材。2017年10月，在武陵山区的湖南省洪江市、桑植县、慈利县、武陵源区和湖北省鹤峰县等地，采集栽培3年的白及样本共8份，每个样地随机采集长势比较接近的带土白及3株，样本经吉首大学唐克华教授鉴定为兰科植物白及[Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.]。收集样株各自所带泥土、干燥留样备测，植株体用自来水冲洗、洗净根茎附着的泥土，晾干表面水分后剪掉样株的须根、包茎叶，将不同生长年限部位精确分离并称量、分类标记，再置于烘箱65 ℃下干燥以便长期贮存，干燥好的样本使用高速多功能粉碎机粉碎并过30目筛，封装标记、保存备用。各样本的产地信息及干燥水分含量见表1。

1.2 试验方法

1.2.1 总酚测定方法。采用Folin-酚比色法，参考文献中的方法并略作修改[11]。精密称取没食子酸标准品10.00 mg，加无水乙醇定容至10 mL，得1.00 mg/mL没食子酸标准品溶液，于4 ℃冰箱保存，临用时先以无水乙醇稀释10倍，然后再取稀释样液1.0 mL用蒸馏水稀释8倍。取稀释好的没食子酸标准品溶液0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40、1.60 mL于10 mL容量瓶中，加入1.00 mol/L的Folin-酚0.5 mL，黑暗条件下放置10 min，再加入1.00 mol/L无水碳酸钠溶液2.0 mL，充分混匀，50 ℃水浴处理10 min，冷却至室温，在770 nm处测定吸光度。以所测样液中的没食子酸质量X（mg）为横坐标、样液吸光度Y为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程为Y=28.606X+0.101 7（R2=0.999 1，线性范围0.005 0～0.017 5 mg）。根据吸光度和标准曲线方程计算样品总酚含量。

1.2.2 单因素试验。以乙醇-水溶液作为提取剂，准确称取经粉碎过30目筛的白及样本（编号SZ）干粉3份。在预试验基础上，以提取时间、乙醇体积分数、提取电压、料液比4个因素的水平值为研究对象。在提取料液比1∶30（g∶mL）、体积分数35%乙醇、提取电压50 V进行闪式提取，分别提取30、60、90、120、150 s，考察提取时间对提取液中总酚得率的影响。在提取料液比1∶30、提取电压50 V、提取时间30 s进行闪式提取，乙醇体积分数分别为35%、50%、65%、80%、95%，考察乙醇体积分数对提取液中总酚得率的影响。在提取料液比1∶30、乙醇体积分数35%、提取时间30 s进行闪式提取，提取电压分别设定为50、80、110、140、170 V，考察提取电压对提取液中总酚得率的影响。在提取电压50 V、乙醇体积分数35%、提取时间30 s进行闪式提取，料液比分别为1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70提取，考察提取料液比对提取液中总酚得率的影响。提取液均经4 000 r/min离心5 min，取上清液按“1.2.1”中方法进行检测。

1.2.3 正交试验设计。在单因素的基礎上，应用SPSS 20.0软件，设计4因素3水平的正交优化试验，以提取液中总酚得率为评价指标，确定闪式提取白及中总酚的最佳条件。正交试验因素与水平设计见表2。

1.2.4 白及总酚提取方法的比较研究。取经粉碎过30目筛的白及样本（编号SZ）干粉3份，分别在不同提取方式下进行提取。其中，回流提取[12-13]为：料液比1∶45，乙醇体积分数95%，提取时间1.5 h;闪式提取为：料液比1∶45，乙醇体积分数95%，提取时间100 s;甲醇研磨提取[14]为：无水甲醇，料液比8∶1，研磨至匀浆，黑暗环境下静置24 h，再经12 000 r/min离心15 min，上清液储存于4 ℃冰箱，备测。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 提取时间的影响。由图1可知，在30～120 s，白及提取液中总酚得率随提取时间延长而增加。提取时间大于120 s 之后，提取液总酚得率下降，推测这可能是提取时间加长导致提取液温度升高，促使提取液中多酚类物质氧化加快，从而导致总酚得率降低。

2.1.2 乙醇体积分数的影响。由图2可知，乙醇体积分数在35%～65%时，提取液总酚得率随乙醇体积分数的升高而升高，当乙醇体积分数达65%以后，提取液的总酚得率开始逐渐降低。分析认为，随着乙醇体积分数提高，一些醇溶性杂质、亲脂性强的成分溶出增加，这些物质成分影响多酚类化合物从原料颗粒中的溶出，从而导致提取液总酚得率降低。

2.1.3 提取电压的影响。由图3可知，提取电压在50～140 V时，提取液中总酚得率随提取电压升高而升高，当提取电压达140 V后，提取液的总酚得率出现降低趋势。分析其原因为：电压控制着闪式提取器的转速，随着提取电压升高，提取器的搅拌转速越大，提取液温度急速上升促使多酚类物质加快氧化，样液中的多酚含量降低。

2.1.4 提取料液比的影响。由图4可知，提取料液比在1∶30～1∶40时，提取液总酚得率随着料液比的增大而快速升高，当料液比大于1∶40之后，提取液中总酚得率逐渐降低。推测原因是：颗粒物料在一定的浓度范围内，随着提取料液比增大，液体传质推力呈相应升高，可促进颗粒物料中提取成分的扩散、溶出，促进成分提取率提高;当物料浓度超出最适范围后，液体传质推动力反而下降，阻碍了颗粒物料中成分的扩散和溶出，提取率相应地下降。

2.2 正交试验

由表3中R值可知，因素B（乙醇体积分数）对闪式提取的影响最大，各因素对总酚提取的影响顺序为B>C>D>A。但方差分析显示，提取时间对白及总酚闪式提取的影响不显著，其他3个因素水平值对白及总酚闪式提取的影响显著。因此，可得最佳提取因素的组合为B1C3D2，即乙醇体积分数55%、提取电压160 V、提取料液比1∶40，提取时间原则上选取最短提取时间100 s，以减轻提取时间延长而增加提取的多酚类物质暴露于空气中被加速氧化的威胁。

准确称取经粉碎过30目筛的白及样本（编号SZ）干粉3份，按照最佳提取组合条件进行验证性试验，得到提取液总酚的平均含量为1.38%，与优化试验中含量最高提取组的很接近，说明优化后的最佳提取组合条件稳定性较高。

2.3 白及总酚提取方法的比较研究

将闪式提取法与文献报道的2种白及总酚提取方法进行比较研究，提取结束后分别测定提取液的白及总酚得率，结果如图5。由图5可知，3种方式提取白及总酚的效率不同，差异较大，以闪式提取法的提取率最高，研磨提取法的最低。闪式提取法的提取率较研磨提取法的提高了138.89%，较回流法提取的提高了57.32%。对于白及总酚提取而言，回流提取法溶剂消耗量大、耗时长，持续加热能耗高，提取率不高;研磨提取法提取量小、提取率较低;闪式提取法提取时间短，而且能够最大限度保护提取总酚的活性，操作简便，提取效率高，安全、环保、经济。

2.4 不同样地栽培白及新生茎的总酚含量差异 按优化获得的最佳闪式提取组合条件，提取测定5个样地的7份栽培白及样本新生茎的总酚含量，结果如图6。由图6可知，5个样地7份栽培白及样本，其新生茎的总酚含量高低为MS>YS>NS>ZJ>HJ>HS>TR。其中，HS（湖北狭叶白及）、TR（湖南桑植引种自贵州铜仁白及）的新生茎总酚含量较低，其中TR最低，仅有0.10%;MS（湖北米氏白及）新生茎总酚含量最高，达0.67%。采用SPSS 20.0分析白及样本总酚含量与样地海拔（表1）相关性，得r=0.571、0.400<|r|<0.600，该结果反映样本总酚含量与样地海拔相关性不显著。

3 结论

闪式提取器凭借其适用范围广，能适用于植物根、茎、叶、花等软、硬材料的快速提取，目前在中药材有效成分提取上的应用十分广泛。试验中首次运用闪式提取法提取白及总酚，优化得出的最佳提取工艺条件：提取时间100 s、乙醇体积分数55%、提取电压160 V、提取料液比1∶40，在此条件下白及提取液中总酚得率为1.38%。以该最佳提取组合条件提取测定比较了7份栽培白及样本新生茎的总酚含量，其最低者为TR（湖南桑植引种自贵州铜仁白及），仅0.10%，最高者是MS（湖北米氏白及），达0.67%。经初步分析表明，白及总酚含量与样地海拔的相关性不显著。

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