异叶茴芹总黄酮的三种提取方法的比较

苏华香 王张英 王志新

[摘要] 比较提取异叶茴芹总黄酮的三种方法：超声辅助提取法、微波辅助提取法、乙醇浸泡提取法的总黄酮提取率，针对超声辅助提取异叶茴芹总黄酮方法，进一步探究其最佳提取工藝。实验结果表明，异叶茴芹总黄酮提取率为：超声波辅助提取>微波辅助提取>乙醇浸泡提取。通过正交试验对超声波辅助提取进行优化，得到超声波辅助提取法最佳提取条件为：料液比1：30，乙醇体积分数60%，超声波处理40min。在此提取条件下，异叶茴芹总黄酮的提取率达到16.98%。

[关键词] 异叶茴芹；总黄酮；提取；正交试验

[中图分类号]S567.239 [文献标识码]A

异叶茴芹（Pimpinella diversifolia DC.）又名山当归、苦爹菜、蛇倒退，是伞形科茴芹属多年生草本植物。异叶茴芹是常用民间草药，可用于活血散淤、解毒消肿，在民间是药食兼用的野菜。异叶茴芹含有黄酮类化合物等多种有效成分。研究表明，黄酮类化合物药用价值丰富，作用广泛且临床研究表明无明显毒副反应，可以调节脂质代谢，具有抗氧化、抗炎、抗菌及提高免疫功能的作用。近年来，对不同植物中总黄酮的提取研究多有报道，但少见对异叶茴芹总黄酮提取方法及提取工艺研究。

本研究通过比较3种提取方法提取异叶茴芹总黄酮的提取率，选出最佳提取方法，进一步设计单因素正交试验，优化出提取异叶茴芹总黄酮的最佳提取条件，为今后异叶茴芹总黄酮资源的开发利用提供实验依据。

1 材料

1.1 实验仪器

FA1204B电子天平（上海精科天美科学仪器有限公司）；SB-5200D超声波清洗机（宁波新芝生物科技有限公司）；EG823LC9-NRH美的微波炉（广东美的微波电器制造有限公司）；KC-100高速粉碎机（北京开创同和科技发展有限公司）；722SP14116可见光分光光度计（上海棱光技术有限公司）；DHG-9040A电热恒温鼓风干箱（宁波江南仪器厂）；TDL-40B台式离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.2 实验材料

实验材料购于福建省宁德市，经衡阳师范学院生命科学与环境学院王志新讲师鉴定，确为异叶茴芹植株。异叶茴芹干燥粉碎后过60目筛，以无水乙醚为有机溶剂，60℃水浴，冷凝回流脱叶绿素，存放在干燥避光处密封保存备用。

1.3 试剂

芦丁标准品（国药集团化学试剂有限公司，20130528）、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、无水乙醚、均为分析纯、体积分数为95%的乙醇、蒸馏水。

2 方法

2.1 芦丁标准曲线的绘制

精确称取芦丁标准品13mg，用60%乙醇溶液溶解（水浴加热），冷却至室温，定容至100 mL的容量瓶中，摇匀，则配制得到浓度为130μg·mL-1的芦丁对照品标准溶液。精密量取芦丁对照品标准溶液0mL，1.0mL，2.0mL，3.0mL，4.0mL，5.0mL，分别置于6支10mL容量瓶中，依次加入体积分数为60%乙醇溶液5.0mL，4.0mL，3.0mL，2.0mL，1.0mL，0 mL，各加入5%亚硝酸钠溶液0.3mL，摇匀，放置5min后，分别加入10%硝酸铝溶液0.3mL，摇匀，放置5min后，各加入4%氢氧化钠溶液4mL，摇匀，最后用60%乙醇溶液定容。静置10min后于510nm处测量吸光度A值，绘制标准曲线。得直线回归方程为：Y=0.0112X-0.004，X为质量浓度（μg·mL-1），Y为吸光度，R?=0.9998。

2.2 样品溶液的制备

精密称取异叶茴芹粉末0.5g，加入一定体积分数的乙醇溶液，用保鲜膜密封，分别置于超声波清洗器，微波炉，常温浸泡提取，离心，收集上清液，放置待测。

2.3 总黄酮含量测定

精密吸取上述各提取溶液0.05mL，置于10mL容量瓶中，依次加入60%乙醇溶液5.0mL、5%亚硝酸钠溶液0.3mL，摇匀，放置5min后，加入10%硝酸铝溶液0.3mL，摇匀，放置5min后，加入4%氢氧化钠溶液4mL，摇匀，最后用60%乙醇溶液定容。静置10min后于510nm处测量吸光度，每种提取液平行测定3次，根据芦丁对照品标准溶液浓度与吸光度标准曲线回归方程计算各提取液中总黄酮浓度（μg·mL-1），取平均值。

总黄酮的提取率=×10-6×100%

C为查标准曲线得到的总黄酮的质量浓度（μg·mL-1）；V为乙醇体积（mL）；M为称取异叶茴芹的质量（g）。

3 结果与分析

3.1 三种提取方法比较

精密称取异叶茴芹粉末0.5g，加入15mL60%乙醇溶液至50mL锥形瓶，用保鲜膜密封，分别置于超声波清洗器中室温超声提取10min，微波炉中加热3min，常温浸泡提取4h，4000r·min-1离心10min，收集上清液，按照2.3项方法计算总黄酮提取率。结果表明超声波辅助提取、微波辅助提取、乙醇浸泡提取所得总黄酮提取率依次降低，分别为15.53%，15.43%和12.70%。实验可知，超声波辅助提取法效果最佳，因此，选取超声波辅助提取异叶茴芹总黄酮。

3.2 超声波辅助提取单因素试验

3.2.1 料液比对异叶茴芹总黄酮提取率的影响 精密称取0.5g异叶茴芹粉末于50mL锥形瓶中，分别加入体积分数60%乙醇溶液5mL，10mL，15mL，20mL，25mL，用保鲜膜密封，置超声波清洗器中室温超声提取10min，4000r·min-1离心10min，收集上清液，用分光光度法测定吸光度，按照2.3项方法计算总黄酮提取率，结果见表1。在料液比从1：10到1：20范围内，总黄酮提取率升高，异叶茴芹总黄酮充分溶于乙醇中。在料液比为1：20到1：50处，提取率逐渐减低。可能是因为随着料液比增大，总黄酮提取液浓度降低，异叶茴芹中其他成分溶于乙醇，使总黄酮浓度相对降低。可见料液比1：20是异叶茴芹总黄酮提取的最佳料液比。

3.2.2 乙醇体积分数对异叶茴芹总黄酮提取率的影响 精密称取0.5g异叶茴芹粉末于50mL锥形瓶中，分别体积分数为30%，40%，50%，60%，70%的乙醇溶液10mL。用保鲜膜密封，置超声波清洗器中室温超声提取10min，4000r·min-1离心10min，收集上清液，用分光光度法测定吸光度，按照2.3项方法计算总黄酮提取率，结果见表2。乙醇溶液体积分数低于60%时，总黄酮提取率随着乙醇体积分数升高而提高，乙醇溶液体积分数高于60%时，总黄酮提取率降低，在60%乙醇处有最佳提取率。总黄酮的溶解与有机溶剂性质相似性有关，相似性越大，溶解率越高，所得总黄酮提速率越大。乙醇体积分数高于60%时，一些醇溶性物质竞争性与乙醇结合，降低了提取液中总黄酮的含量，提取率减小。

3.2.3 提取时间对异叶茴芹总黄酮提取率的影响 精密称取0.5g异叶茴芹粉末于50mL锥形瓶中，加入体积分数60%乙醇溶液10 mL，用保鲜膜密封，分别置超声波清洗器中处理10min，20min，30min，40min，50min，4000r·min-1离心10min，收集上清液，用分光光度法测定吸光度，按照2.3项方法计算总黄酮提取率，结果见表3。超声波辅助提取异叶茴芹总黄酮40min是最佳的提取时间。超声波处理时间在10～40min以内，处理时间越长，乙醇和异叶茴芹粉末接触更加充分，提取的黄酮量越大，提取率也越高。继续延长浸泡时间至50min时，提取率反而比40 min时的提取率小。由于长时间震荡，使一些不稳定的黄酮类物质开始分解，提取液中的黄酮类化合物含量降低，提取率减小。

3.3 超声波辅助提取正交试验

根据以上单因素试验结果，按照L9（33）设计正交试验，见表4，正交试验结果及方差分析见表5，表6。

由表5可知，极差RA>RC>RB，即超声波辅助提取影响总黄酮提取率的大小为：料液比>提取时间>乙醇体积分数。直观分析超声波辅助提取最佳提取工艺组合为A3B2C2。由表6可知，料液比、乙醇体积分数及提取时间都对总黄酮提取率具有极显著影响，其中料液比对总黄酮提取率影响最大，三个实验因素之间相互作用显著。因最佳提取工艺组合不在正交表，设计试验提取条件为料液比1：30，乙醇体积分数60%，超声波处理40min，提取率为16.98%，验证A3B2C2为最佳提取工艺。

4 讨论

黄酮类化合物具有多种生物活性，现已有诸多利用不同植物提取总黄酮的研究，是国内外天然药物研发的热点。本实验以乙醇为提取剂从异叶茴芹全草提取总黄酮，对超声波辅助提取法、微波辅助提取法、乙醇浸泡提取三种方法提取效果进行比较，并进一步对超声波辅助提取工艺进行探究。实验结果表明总黄酮提取率为：超声波辅助提取>微波辅助提取>乙醇浸泡提取。异叶茴芹总黄酮含量较高，三种方法提取率均高于12%，與乙醇浸泡提取相比，超声波辅助提取法和微波辅助提取法能缩短提取时间，所得异叶茴芹中总黄酮提取率高。微波辅助提取法处理时间比超声波辅助提取法更短，但难以操作，如：微波处理时因温度高，提取液易挥发或喷瓶。超声波辅助提取法易于操作，且提取率高，最适合用于提取异叶茴芹总黄酮。采用正交试验优选出超声波辅助提取法最佳提取条件为料液比为1：30，乙醇体积分数60%，超声波处理40min，提取率达16.98%。本研究为今后提取异叶茴芹总黄酮提供了一定的数据参考。

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