烟草赤星病菌的Biolog代谢表型分析

李六英 王甲军 张炜 陈美均 马冠华 于庆涛 帅红

摘 要：为了解我国烟草赤星病的2种主要致病菌链格孢菌Alternaria alternata和長柄链格孢菌Alternaria longipes的碳氮源代谢表型。采用Biolog表型芯片技术分析了2株链格孢菌（中等致病力的CQ1和GZ11）及2株长柄链格孢菌（强致病力的HuN2和弱致病力的YN4）对PM1、PM2微孔板中190种碳源物质和PM3微孔板中95种氮源物质的代谢情况。结果发现，4株赤星病菌均能代谢PM1-PM3微孔板中24.21%的碳源和86.31%的氮源。不同致病力菌株间的碳氮源代谢能力表现出一定差异，长柄链格孢菌的强致病力菌株HuN2比弱致病力菌株YN4对D-甘露糖、D-木糖、D-甘露醇、b-环糊精、L-缬氨酸、D-天门冬酰胺、腺苷和i-赤藓糖醇等物质的代谢更显著；链格孢菌的中等致病力菌株CQ1比GZ11对L-鼠李糖、海带多糖和二羟基丙酮的代谢更好；弱致病力菌株YN4比强致病力菌株HuN2和中等致病力菌株CQ1、GZ11对水杨苷的代谢更明显。表明烟草赤星病菌的不同种群菌株对碳氮源的代谢情况总体趋势一致，但不同致病力菌株间存在一定差异。

关键词：烟草赤星病菌；Biolog表型芯片技术；代谢表型

中图分类号：S435.72 文章编号：1007-5119（2018）05-0079-07 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2018.05.011

Abstract： Tobacco brown spot is a fungal disease occurring at the late stage of tobacco maturation， which is mainly harmful to tobacco leaf and seriously affects tobacco production in China. In order to understand the carbon and nitrogen source utilization phenotypes of Alternaria alternata and Alternaria longipes which are two main pathogenic fungi of tobacco in China. CQ1 （moderately virulent） and GZ11 （moderately virulent） of A. alternata as well as HuN2 （most virulent） and YN4 （weak virulent） of A. longipes were selected to analyze the utilization of 190 species of carbon source materials in the microplates of PM1 and PM2， 95 species of nitrogen source of PM3 using the Phenotype Microarray System. The results revealed that the utilization of carbon and nitrogen sources of the four tested strains were roughly similar， the utilization ratio of carbon and nitrogen sources were 24.21% and 86.31%， respectively. There were also some differences among them， for A. longipes， the most virulent HuN2 had a better use of D-Mannose， D-Xylose， D-Mannitol， b-Cyclodextrin， L-Valine， D-Asparagine， L-Asparagin， Adenosine， i-Erythritol， and so on than the weak virulent YN4. For A. alternata， the moderately virulent CQ1 had a better ability in using L-Rhamnose， Laminarin and Dihydroxyacetone than GZ11. Additionally， the weak pathogenic strain YN4 was better than HuN2， CQ1 and GZ11 in using Salicin which indicated that there were obvious utilization variance in different types of pathogenicity.

Keywords： Alternaria alternata and Alternaria longipes； phenotype microarray system； metabolic phenotype analysis

烟草赤星病（Tobacco brown spot）是发生于烟株生长后期的真菌性病害，主要为害成熟叶片，近年来在我国造成的危害逐年加重，严重威胁各烟区的烟叶生产[1-3]。碳氮源是微生物生长过程中获取能量关键的基础营养物质[4]。病原菌能否正常生长甚至发展成优势致病菌，对碳氮源物质良好的代谢能力是一个重要因素[5]。了解不同致病力种群病原菌的碳氮源代谢情况，能够为研究病原菌的营养利用、环境适应能力、与寄主植物互作以及致病机理提供理论信息[6]。可为针对性进行抗病品种选育及病害控制提供重要信息。

分析碳氮源物质的利用情况是解释微生物代谢表型的基础。传统的微生物碳氮源利用试验是通过添加碳氮源物质于培养基中进行测定[7]，测试物质种类有限且操作繁琐。Biolog表型芯片技术（Phenotype Microarray System，PMs）是一种测定微生物代谢活动的高通量技术，该技术能快捷地获得微生物种群代谢碳氮源的大量数据，反映出微生物活性的丰富信息[8]。已有研究利用Biolog表型芯片技术分析了不同环境中复杂微生物的表型特性[9]、不同土壤样品质地[10]、野生型和突变型菌株的生物学特性[11]，以及辅助基因组学和蛋白质组学研究基因改变后生物的表现型和功能变化[12]。

目前，关于烟草赤星病菌在病原鉴定[13]、药剂筛选[14]和烤烟新品种选育[15-17]等方面研究较多。而在表型组学分析方面，只有WANG等[18] 报道了1株链格孢菌（Alternaria alternata）对20块PM微孔板中各类物质的代谢情况。为了解赤星病的2种主要致病菌链格孢菌（A. alternata）和长柄链格孢菌（A. longipes）种群中不同致病力菌株的碳氮源代谢表型，本研究采用Biolog表型芯片技术测定了2株链格孢菌和2株长柄链格孢菌的不同致病力菌株对190种碳源物质和95种氮源物质的代谢情况， 以期为进一步了解赤星病菌的代谢机制和选育抗赤星病烟草品种提供理论信息。

1 材料与方法

1.1 材料

供试病原菌：链格孢菌（Alternaria alternata）种群的中等致病力菌株CQ1和GZ11与长柄链格孢菌（A. longipes）种群的强致病力菌株HuN2和弱致病力菌株YN4，由西南大学植物生态病理研究所提供。

培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉17 g，蒸馏水定容至1 L，121 ℃灭菌30 min。

试验器材：PM1、PM2和PM3微孔板（货号：#12111、#12112、#12121），FF-IF接种液（#72106），V型加样槽（#3002），美国Biolog公司。

供试药剂：D-葡萄糖（#G5400），硫酸钠（#S9627），磷酸二氢钾（#P53276），Sigma公司。

主要儀器设备：OmniLog PM系统（#71000），8通道电动移液器（#3710）和浊度计（#3531），美国Biolog公司。

试验时间及地点：本研究于2018年1—3月在西南大学植物生态病理研究所完成。

1.2 试验方法

1.2.1 烟草赤星病菌对PM碳氮源代谢的测定 参照WANG等[18]的方法并加以改进。将供试菌株于PDA培养基上25 ℃黑暗培养7 d，用少量无菌蒸馏水洗下分生孢子，无菌双层纱布过滤，再加无菌蒸馏水将孢子悬浮液稀释到1×105个/mL。用FF-IF接种液调整孢子悬浮液浓度，使其透光度为62% T（T为Biolog标准浓度单位）。迅速将配制好的菌悬液倒入V型槽中，用电动移液器将孢子悬浮液分别接种至PM1、PM2微孔板中，每孔100 μL；加入PM3板前，需往62% T孢子悬浮液中加入D-葡萄糖、磷酸二氢钾和硫酸钠，使其在孢子悬浮液中的终浓度分别为100 mmol/L、5 mmol/L和2 mmol/L，再将此孢子悬浮液移至PM3板微孔中，每孔100 μL。PM1、PM2和PM3板置于Biolog系统培养箱中28 ℃培养7 d，设置OmniLog软件，由OmniLog 2.4系统每15 min读数一次。

1.2.2 数据处理与分析 利用Biolog D5E_OKA_ data.exe软件收集各菌株的代谢表型数据，并用Biolog OL_FM_1.2.exe软件进行数据转换。对相同PM板，2株病原菌的代谢动力学曲线分别用红色和黄色标记，采用Biolog OL_PR_1.2.exe软件将两组数据进行对比分析，选择峰面积（Aera）为对比参数，Aera越大，表明菌株对被检测营养物质的代谢越强，共同代谢的区域标记为黄色；根据代谢孔颜色面积的大小分析2株菌株的代谢表型差异。

2 结 果

2.1 烟草赤星病菌对PM1和PM2中碳源代谢表型分析

通过代谢表型组学分析，获得4株烟草赤星病菌（CQ1、GZ11、HuN2和YN4）对190种碳源代谢表型信息。4株赤星病菌均能够代谢PM1微孔板中包括糖类、核苷酸、羧酸类等95种碳源物质中的25种物质而产生颜色反应，利用率达26.31%（图1）。高效代谢的碳源有13种，包括L-阿拉伯糖（PM1，A02）、D-甘露糖（PM1，A11）、D-山梨醇（PM1，B02）、D-木糖（PM1，B08）、D-甘露醇（PM1，B11）、D-核糖（PM1，C04）、L-鼠李糖（PM1，C06）、a-D-乳糖（PM1，D09）和果糖（PM1，D10）等（表1）。各菌株碳源代谢产生的动力学曲线叠加分析表明，4株病菌的碳源代谢图谱基本一致。但是长柄链格孢种群的强致病力菌株HuN2对D-甘露糖（PM1，A11）、D-木糖（PM1，B08）和尿苷（PM1，D11）等的代谢效率较弱致病力菌株YN4强；链格孢种群的中等致病力菌株CQ1、GZ11对25种物质的代谢能力相当，只有CQ1对L-鼠李糖（PM1，C06）比GZ11的代谢更强（图1）。

4株菌株均能代谢PM2微孔板中95种碳源物质中的b-环糊精（PM2，A04）、海带多糖（PM2，A10）和D-阿拉伯糖醇（PM2，B06）等21种，利用率为22.11%，而不能利用硫酸软骨素C（PM2，A02）等74种物质。在能够代谢的21种碳源物质中，强致病力菌株HuN2比弱致病力菌株YN4对b-环糊精（PM2，A04）、g-环糊精（PM2，A05）、i-赤藓糖醇（PM2，B10）和奎尼酸（PM2，F06）等的代谢更好；而弱致病力菌株YN4对水杨苷（PM2，D02）的代谢比强致病力菌株HuN2以及中等致病力菌株CQ1、GZ11都明显更好；中等致病力菌株CQ1、GZ11对21种碳源物质的代谢能力基本一致，只有CQ1对海带多糖（PM2，A10）和二羟基丙酮（PM2，H09）比GZ11代谢更强（图1）。

2.2 烟草赤星病菌对PM3中氮源代谢表型分析

通过分析4株烟草赤星病菌对PM3中95种氮源代谢表型信息发现，4株赤星病菌均能利用PM3中的缩二脲（PM3，A06）、L-缬氨酸（PM3，C02）和腐胺（PM3，D11）等82种氮源物质而产生颜色反应，代谢率达86.31%，明显高于其对PM1、PM2中碳源物质的代谢。4株病原菌对PM3氮源代谢指纹图谱基本相似，能够利用的物质种类基本一致，

但是不同菌株间代谢程度也存在一定差异。中等致病力菌株CQ1与GZ11利用程度相似性较高，动力曲线图形重合度也较高，而强致病力菌株HuN2比弱致病力菌株YN4对D-天门冬酰胺（PM3，C04）、L-缬氨酸（PM3，C04）、L-鸟氨酸（PM3，C12）和腺苷（PM3，F03）等的代谢明显较强（图1）。

3 讨 论

一种病原菌能否成为优势群体的关键是环境适应能力，而评价环境适应能力最直观的是表型变化。Biolog表型芯片技术具有高通量、速度快、准确性高、能动态反应微生物细胞代谢的生化过程等优点，在国外已被广泛应用于微生物领域的研究[19-21]。

同时，已有研究表明，葡萄糖、果糖、蔗糖等和部分氨基酸等碳源对微生物的生长是必须的。本研究对烟草赤星病的主要致病菌中链格孢和长柄链格孢的不同致病力代表菌株（CQ1、GZ11、HuN2和YN4）比较分析发现，4株烟草赤星病菌对PM1、PM2中190种碳源物质以及PM3中95种氮源物质的代谢图谱总体趋势基本一致，碳源利用率为24.21%，氮源利用率为86.31%。这一结果与WANG等[21]采用PMs研究的1株贵州烟草赤星病菌对PM1-PM3中碳氮源代谢率相近，其代谢率分别为24.74%和85.26%。不过，赤星病原菌群体在碳氮源的种类利用上是否具有相似性还需测试更多菌株进行分析。

4株烟草赤星病菌对供试碳氮源代谢率总体上表现出相似性，但是不同致病力菌株的代谢能力呈现出一些差异。强致病力菌株HuN2比弱致病力菌株YN4对D-甘露糖（PM1，A11）、D-木糖（PM1，B08）、b-环糊精（PM2，A04）和腺苷（PM3，F03）等的代谢程度更高；中等致病力菌株CQ1比GZ11对少许物质L-鼠李糖（PM1，C06）、海带多糖（PM2，A10）和二羟基丙酮（PM2，H09）代谢明显更强；弱致病力菌株YN4對水杨苷（PM2，D02）的代谢比强致病力菌株HuN2以及中等致病力菌株CQ1、GZ11都明显更强，表明烟草赤星病菌个体间存在

一定的代谢表型差异。表型是生物遗传基础的外在表现，本研究前期分析发现烟草赤星病菌具有丰富的遗传多样性（另文发表），这也进一步证实赤星病菌遗传多样性与种群内代谢表型和致病力差异相关。

已有研究发现，不同碳水化合物分别调控植物叶片的生长发育[22]、乙烯的形成等[23]，有的生化代谢只存在于叶片表面[24]，有的仅发生在叶片成熟过程中[25]。而赤星病菌基本不侵染幼嫩叶片而是在成熟期侵染为害[26]。本研究发现赤星病菌（A. alternata，A. longipes）可以利用大部分氮源（86.31%），而较少种类的碳源能够被其代谢（24.21%）。碳源是微生物生命活动中的重要元素，成熟烟叶内化学成分或表面分泌物可能含有某些特有的碳源，这些碳源有利于赤星病菌的生长和繁殖，从而导致赤星病的发生与为害。不同品种之间的抗赤星病能力差异[27]是否与D-甘露糖、D-木糖、L-鼠李糖、水杨苷等物质在不同烟草品种中的含量有关还有待于进一步深入研究。

4 结 论

通过Biolog表型芯片技术测定了4株烟草赤星病菌对190种碳源物质以及95种氮源物质的代谢情况。结果发现，4株菌株对PM1、PM2及PM3微孔板的碳氮源物质代谢总体上一致，碳源利用率为24.21%，氮源利用率86.31%。但是强致病力菌株对部分碳源物质的代谢相对中等致病力菌株以及弱致病力菌株更强，弱致病力菌株对个别物质的利用程度较中等和强致病力菌株更好。本文获得的赤星病菌的代谢表型组学信息有助于了解烟草赤星病菌不同致病力菌株与烟株互作过程中病原菌的碳氮源代谢情况，为烟草抗赤星病品种的选育提供了理论信息。今后有待于深入研究不同生长时期烟株内碳氮源物质种类和含量情况，明确其与赤星病菌侵染和为害的关系以及赤星病菌对碳氮源的代谢机制。

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