烤烟烟碱转运蛋白基因与烟碱积累的相关性研究

尹鹏嘉 任民 陈爱国 孙鑫 周世奇 张玉 罗成刚 杨爱国 徐宗昌 文柳璎

摘 要：解析烟碱转运相关基因对烟碱积累的影响，可为定向改良烟碱性状提供理论指导。本研究对7份烟碱含量不同的烤烟进行水培，检测打顶前后烟碱含量、烟碱合成基因（NtPMT、NtQPT）、烟碱转运基因（NtNUP1、NtJAT1/2、NtMATE1/2）以及囊泡运输调节基因（NtGEF）的表达量变化。经相关分析、主成分分析和相关网络分析表明：（1）烟碱合成基因NtPMT、NtQPT与烟碱转运基因NtNUP1、NtMATE1/2相互促进表达；（2）根部和叶部的主效烟碱转运基因中，NtJAT1是腰叶的主要烟碱转运基因，NtNUP1、NtJAT1、NtMATE1/2在根部对烟碱转运都有贡献，且转运效率依次递减；（3）囊泡运输调节因子NtGEF也能间接影响叶部烟碱积累。因此，在对烟碱性状进行定向改良时，可考虑烟碱合成、转运以及囊泡运输调节因子对烟碱积累的贡献大小。

关键词：烤烟；转运基因；烟碱积累；相关性

中图分类号：S572.03 文章编号：1007-5119（2018）05-0025-08 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2018.05.004

Abstract： In order to provide theoretical guidance for high quality tobacco breeding， analysis of contribution from nicotine transport related factors to nicotine accumulation was conducted. Seven flue-cured tobacco germplasms with different nicotine contents were planted in hydroponics devices and were treated by topping. The nicotine content， and expression levels of 2 key nicotine biosynthetic genes （NtPMT， NtQPT） and 3 transporters genes （NtNUP1， NtMATE1/2， NtJAT1/2） and a vesicular traffic regulator gene （NtGEF） were detected and analyzed. Correlation analysis， principal component analysis and related network analysis were conducted. The results showed that： （1） expression of nicotinic biosynthetic genes （NtPMT and NtQPT） and nicotine transporter genes （NtNUP1 and NtMATE1/2） was promoted by each other； （2） nicotine transporter genes that play dominant roles in leaves and roots were different. NtJAT1 was the dominant transporter in middle leaves； NtNUP1， NtJAT1 and NtMATE1/2 genes were the main genes of nicotine transportation in the root， with their transporting efficiency decreased in the above listed order； （3） the vesicular traffic regulator gene （NtGEF） also indirectly affected the accumulation of nicotine in middle leaves. Therefore， when seeking directional improvement for nicotine content， breeders should consider the influence of nicotine synthesis genes， transporter genes and vesicle transport regulatory factors on nicotine accumulation.

Keywords： flue-cured tobacco； transport efficiency； nicotine accumulation； expression analysis

烟碱是烟草的重要品質性状之一，解析烟碱合成转运基因对烟碱转运积累的影响，可为烟草品质定向改良提供理论指导。烟碱在烟草根部合成，通过木质部运输到地上部分，多数储存在叶肉细胞的液泡中[1-2]。烟碱的合成积累受到多种因素影响，其中遗传是主要因素。目前，已报道5种转运蛋白具有转运烟碱的功能。研究表明，烟碱转运蛋白NtNUP1定位于质膜上，在根尖中较强表达，对烟碱转运有很高的特异性；NtNUP1主要负责将胞质外体的烟碱转运至胞质内，从而维持根部烟碱平衡[3-4]。其余4个转运蛋白属于多药与毒素外排家族（Multidrug and Toxic Compound Extrusion，MATE），除转运烟碱外还转运其他底物。SHOJI等[5]研究发现，位于烟草根部液泡膜上的烟碱转运蛋白NtMATE1/2调控根部液泡内烟碱的平衡。MORITA等[6]发现位于液泡膜上的烟碱转运蛋白NtJAT1在根、茎、叶中都有表达，特别在绿叶中表达显著，NtJAT1主要负责烟碱与质子转运。另一种MATE家族的烟碱转运蛋白NtJAT2在叶片中特异性表达，定位于叶部液泡膜上[7]。烟碱在根部合成的过程主要受NtPMT、NtQPT两个关键基因调控[8-11]。此外，多数蛋白质通过囊泡运输实现在细胞内的分选和定位，而鸟苷酸交换因子GEF具有激活Rab5蛋白的功能，可以调节蛋白质从高尔基到液泡的运输[12]，因此推测NtGEF基因可能参与转运蛋白的亚细胞定位，进而影响烟碱的转运积累。

虽然已知烟草中NtGEF、NtNUP1、NtMATE1/2、NtJAT1/2等多个因子直接或者间接地参与了烟碱的转运，但是这些基因对烟碱积累的贡献大小以及其烟碱转运效率的关系如何还未见报道。本研究采用分子生物技术及多种统计分析方法对7个烤烟品种的烟碱含量与烟碱转运、合成相关基因进行检测并分析，旨在为定向培育高烟碱品质烟草的育种工作提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

7份不同烟碱含量的烤烟品系种质资源（长葛

柳叶，09-53，NCTG-61，9201，大柳条，OX2028，K326）由国家烟草种质资源中期库提供。其中高烟碱烤烟品种3份，低烟碱烤烟品种3份，对照采用全国主栽培品种K326。

1.2 试验时间、地点

本试验于2016—2017年在中国农业科学院烟草研究所进行，试验材料苗期在人工气候培养室培养[平均气温（25±2） ℃，相对湿度（60±5）%，光照12 h、黑暗12 h]，移栽期至成熟期在温室培养[平均气温（28±2） ℃，相对湿度（50±5）%，光照12 h、黑暗12 h]。

1.3 试验方法

1.3.1 水培装置与营养液的制备 试验材料苗期与成熟期的培养均采用水培，水培营养液采用Hoagland 全营养液，培养方式采用泡沫板漂浮培养，水培设备及布局参照专利标准[13]。

1.3.2 样品采集及烟碱含量的测定 分别在打顶前和打顶后20 d，选择生长状态一致的烟株，并对烟株的腰叶、根部进行取样，每3株混合为一个样本，取3次生物学重复，用锡箔纸包裹后放入液氮，分别用于RNA提取和冷冻干燥。同时把采收的鲜烟叶用105 ℃杀青30 min并烘干[14]，制成烟叶样品。杀青后烟叶样品烟碱含量测定在农业部烟草产业产品质量监督检验测试中心进行，检测方法参照行业标准YC/T 217—2007，计算打顶后烟碱含量的增加量（Y）。

1.3.3 RNA的提取及qRT-PCR检测 用RNAiso Plus（Takara，Code No.：9108）提取烟叶和烟根的总RNA，并用凝胶电泳和超微量分光光度计检测 RNA 的浓度和质量，采用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara，Code No.：RR047）将总 RNA 反转录成cDNA，稀释5倍后利用 SYBR? Premix Ex Taq TM（Takara，Code No.：RR820）在荧光定量 PCR仪ABI 7500上进行qRT-PCR分析，其扩增程序参考文章标准[15]，每个样品做3次技术重复。实验中各个基因的特异引物见表2，其中NtMATE1/2、NtJAT2、NtGEF基因引物用Primer-BLAST（http：//www. ncbi.nlm. nih.gov/ tools/primer-blast/）设计，NtPMT、NtQPT、NtJAT1、NtNUP1基因引物参考文献[4，6，16]。内参基因NtActin引物参照ZHANG等[16]文章。

1.4 数据分析

采用Excel 2013进行主成分分析数据标准化[17]处理，计算平均值、标准差及变异系数，实时荧光定量PCR数据计算采用2-△△CT方法计算[18]，用Graph Prism软件中的Tukey法进行单因素方差分析，采用SAS 9.2[19-21]数据处理系统进行相关分析、主成分分析等统计分析，用UCINET6.0软件[22]作烟碱与基因及基因之间的相关网络图。

2 结 果

2.1 打顶前后腰叶烟碱含量差异分析

由表2可以看出，在打顶后，腰叶烟碱含量均有不同程度的升高，说明打顶这一农艺措施对烟草烟碱的产生与积累具有积极的诱导作用。打顶后供试品种腰叶烟碱含量变异系数达54.55%，高于打顶前的烟碱含量变异系数47.05%，而打顶后的烟碱含量增加量的变异系数更是达到了80.96%，说明打顶后烤烟品种的烟碱含量开始急剧增加，不同烟碱种质烤烟的烟碱含量也是在打顶后才开始出现明显的变化。在打顶后，大柳条的烟碱含量增幅最大，OX2028、09-53次之，说明烤烟烟碱含量受品种因素的影响较大。以上结果说明，打顶前后各个烤烟品种之间烟碱含量变异丰富，反映出不同品种的真实变化，可代表田间烤烟品种用于烟碱增量与烟碱基因表达的相关性分析。

2.2 打顶前后腰叶及根部烟碱基因表达量分析

分别对腰叶与根部2个组织的烟碱合成、转运相关基因表达量检测，并计算打顶后相对于打顶前的相对表达量，用单因素方差分析法对差异显著的基因进行标识（表3）。结果表明，在成熟期葉部，打顶后的各个与烟碱代谢相关的基因相对打顶前表达量大部分上调，可以根据叶部5个基因的表达情况，把5个基因分成2类，第1类基因（NtGEF、NtJAT2、NtNUP1）在各供试品种中表达量均上调显著；第2类基因（NtQPT、NtJAT1）在各试验材料中既有上调也有下调表达，但多为上调表达。在成熟期根部，打顶后的各个与烟碱代谢相关的基因相对打顶前表达量既有上调也有下调，可以根据叶部7个基因的表达情况，把7个基因分成2类，第1类基因（NtJAT2、NtPMT、NtNUP1、NtGEF）在除NCTG-61外的供试品种中均为上调表达，第2类基因（NtJAT1、NtMATE1/2、NtQPT）供试品种中既有上调表达也有下调表达。

2.3 腰叶烟碱增量与叶部烟碱相关基因相关分析

对供试烤烟品种腰叶烟碱增量及5个烟碱转运、合成基因的简单相关分析（表4）表明，烟碱增加量（Y）只与NtJAT1呈显著正相关。意味着腰叶中，烟碱转运蛋白基因中可能只有NtJAT1的表达起主要作用，且NtJAT1转运烟碱的贡献多于NtJAT2。此外，NtGEF与NtQPT呈极显著正相关，说明在腰叶中，囊泡运输调节因子NtGEF与烟碱合成基因NtQPT的表达相互促进。由此可见，叶部烟碱相关基因之间也存在显著的相关关系，所以仅根据简单相关分析不能完全揭示其内部真实性关系。

2.4 腰叶烟碱增量与叶部烟碱相关基因的主成分分析

为对腰叶烟碱增量与基因表达量原始数据进行降维及防范基因之间多重共线性，采用主成分分析法对烟碱含量及烟碱合成、转运基因进行分析（表5）。结果表明，影响烟碱增量的前2个主成分共同解释了所有综合信息的79.21%，且特征值均大于1，因此，可初步用于筛选影响烟碱增量的基因。

由表5可知，主成分1特征向量中载荷较高的主成分为NtQPT与NtGEF且符号与烟碱增量（Y）相同，说明腰叶中，NtQPT和NtGEF表达量变化越大烟碱增量也越大。NtQPT的原始变量对主成分1的影响程度为0.9684，大于NtGEF，表明NtQPT对烟碱增量的贡献大于NtGEF。主成分2的特征向量中载荷较高的主成分为NtJAT1，说明腰叶中，烟碱转运蛋白NtJAT1的基因表达量变化对烟碱增量影响也较大。此外，主成分1的贡献率大于主成分2的，说明腰叶中NtGEF、NtQPT的表达变化对烟碱增量的影响大于NtJAT1。

2.5 腰叶烟碱增量与根部烟碱相关基因分析

对供试烤烟品种腰叶烟碱增量与根部7个烟碱转运、合成基因进行简单相关分析（表6），烟碱合成基因NtNUP1与烟碱增量（Y）呈显著正相关（0.8493），说明NtNUP1对烟碱积累的直接影响显著。另外，NtMATE1/2与NtQPT呈极显著正相关，NtNUP1与NtPMT也呈显著正相关，相关系数达0.8887，说明在烤烟根部的烟碱转运基因（NtNUP1、NtMATE1/2）与烟碱合成基因（NtPMT、NtQPT）的表达相互促进。可见根部烟碱相关基因之间也存在显著的相关关系，所以仅根据简单相关分析不能完全揭示其内部真实性关系。

2.6 腰叶烟碱增量及根部烟碱相关基因的主成分分析

为了排除不同基因之间的相关关系对烟碱增量的间接影响，采用主成分分析方法对其进行分析（表7）。结果表明，影响腰叶烟碱含量变化的前3个主成分共同解释了所有综合信息的90.61%，且特征值均大于1。因此，可初步用于筛选影响烟碱增量的在根部表达的烟碱相关基因。

由表7可知，主成分1的特征向量中载荷量较高的主成分为NtPMT、NtNUP1，且符号与打顶前后腰叶烟碱增加量（Y）相同，说明在打顶后根部NtPMT、NtNUP1表达量上调倍数越高则腰叶烟碱增量也越大；主成分2的特征向量中载荷较高的主成分为NtJAT1、NtMATE1/2，且符号与打顶前后腰叶烟碱增量（Y）相同，说明打顶后根部NtJAT1、NtMATE1/2的表达量变化越大，则腰叶烟碱增量也越大；主成分3的特征向量中载荷较高的主成分为NtGEF（0.937 9），且符号与打顶前后腰叶烟碱增量（Y）相同，说明在根部NtGEF的表达量倍数变化越大，腰叶烟碱积累量也越大。此外，主成分1的贡献率为46.21%>主成分2（30.68%）>主成分3（13.72%），说明主成分1至主成分3对原始变量的解释力度依次减弱，意味着这些基因对腰叶烟碱增量的贡献降低，从大到小依次为根部NtPMT、NtNUP1的表达量变化效应大于NtMATE1/2、NtJAT1的，继而大于NtGEF的。而主成分1的原始变量中，NtPMT对主成分1的影响系数为0.975 7，大于NtNUP1（0.965 9），在主成分2的原始变量中，NtJAT1对主成分2的影响系数为0.924 2，大于NtMATE1/2（0.855 3）。说明根部烟碱合成基因NtPMT对腰叶烟碱增量的贡献大于NtNUP1，烟碱转运基因NtJAT1对腰叶烟碱增量的贡献大于NtMATE1/2。

2.7 腰叶烟碱增量及烟碱相关基因的网络关系

为了更加清晰准确地展现腰叶烟碱增量与烟碱转运、合成基因的关系以及各个因子之间的关系，基于简单相关系数，用UCINET 6.0分析软件制作腰叶烟碱增量及烟碱转运蛋白基因、烟碱合成基因之间的相关网络图（图1A，B）。从分析结果来看，不同的节点有着不同的属性，节点间有着丰富的关系属性。在腰叶的相关网络图中，入度较高的节点即在整个腰叶烟碱积累中，有较高影响力的节点。图中烟碱增量（indegree=4）、NtQPT（indegree=3），说明NtQPT在腰叶的烟碱积累过程中有较大贡献。接近中心度最小的点为NtQPT（closeness=20）、NtGEF（closeness=20），说明2个基因在网络中独立性最强，其表达不易受到其他基因的影响。而出度最高的是NtGEF（outdegree=4），说明NtGEF是此网络中与其他基因表达有交互作用最多的点。在与烟碱有交互的基因中，NtJAT1的交互强度最高，达到0.9，说明NtJAT1是腰叶中最主要的烟碱转运基因，而NtJAT2对烟碱的转运效率最低。

从图1B中可以看出，在根部的烟碱合成及转运的网絡中，入度较高的节点即在整个腰叶烟碱积累过程中有较高影响力的节点有烟碱增量（indegree=6）、NtMATE1/2（indegree=4）、NtNUP1（indegree=3），说明NtMATE1/2、NtNUP1在烟碱转运积累过程中有较大作用。接近中心度最小的点为NtNUP1（closeness=26）、NtGEF（closeness=26），说明2个基因在网络中独立性最强，其表达不易受到其他点的影响。而出度最高的点是NtGEF（outdegree=6），说明NtGEF是此网络中与其他基因表达有交互作用最多的点，NtGEF与NtMATE1/2、NtJAT1的交互强度为0.9，说明NtGEF对2个基因的表达影响最大。此外，与烟碱增量有交互作用的烟碱转运基因中，NtNUP1交互强度最高达0.9，说明根部NtNUP1转运烟碱的效率最高，NtJAT1，NtMATE1/2次之。

3 讨 论

3.1 创伤影响烟碱相关基因表达

创伤可诱导烟碱转运，合成基因上调表达[6]。为避免根部损伤导致烟碱相关基因表达变化，本研究采用新型水培循环系统，对高低烟碱烤烟品种进行种植。在该试验条件下，7个烤烟品种打顶后的叶部烟碱含量相比于打顶前均增高，说明用温室水培体系培养的烟草也表现出田间烟草植株积累烟碱的规律[23-26]，这为分析烟碱相关基因的表达提供稳定的检测环境。

3.2 在葉部表达且对烟碱积累有影响的基因

对烟草腰叶中烟碱积累与打顶前后相关基因表达差异分析显示，腰叶中NtJAT1、NtQPT、NtGEF 3个基因是影响腰叶中烟碱增量的主要因子，NtJAT1是腰叶中最主要转运烟碱的基因。张震彪等[27]报道腰叶在落黄过程中，转运蛋白NtJAT1表达上调，本研究中NtJAT1基因在7个品种的腰叶中均为上 调表达，进一步说明在不同烟草品种中，NtJAT1基因对腰叶中烟碱积累均起到首要作用。

3.3 在根部表达且对烟碱积累有影响的基因

烤烟根部是烟碱合成和起始转运的主要器官，共筛选出5个影响烟碱增量的主要因子，分别为NtPMT、NtNUP1、NtJAT1、NtMATE1/2、NtGEF。烟碱合成基因NtPMT的表达对烟碱增量的贡献大于3个烟碱转运基因（NtNUP1，NtMATE1/2，NtJAT1）和囊泡运输调节因子（NtGEF）。而KATO等[4]的研究表明NtNUP1是根部最主要的转运基因。本研究中，在根部3个烟碱转运基因中，NtNUP1对烟碱的增加贡献最高，且表达量与腰叶烟碱增量呈极显著正相关。这进一步证明不同烟草品种间，根部NtNUP1基因对烟碱积累均起到首要作用。

本研究中烟草中囊泡运输调节因子（NtGEF）的基因表达对腰叶烟碱增量也有影响。已报道水稻OsGEF蛋白对去向液泡的蛋白运输具有显著的调控作用[28]，而本研究中根部NtGEF与几个烟碱转运基因有交互作用，并且NtGEF对NtMATE1/2、NtJAT1 2个基因的表达影响最大，推测NtGEF可能通过介导烟碱转运蛋白（MATE1/2、NtJAT1）的定位来影响烟碱的积累。由此可推测，除已报道的烟碱合成、代谢途径基因之外，还有其他未知因子参与烟碱积累。

3.4 遗传对烟碱积累和相关基因的影响

品种遗传背景是影响烟碱含量的主要因素[30-31]，不同烟碱含量的7个烟草品种，打顶前、后的烟碱含量在品种间增加差异较大。同时烟碱相关基因的表达量变化幅度在不同品种间表现不一致，这可能与各品种遗传背景有很大关系。揭示影响烟碱积累遗传因子还需要持续深入研究。

目前我国烟叶生产普遍存在上部叶烟碱含量偏高的问题，影响烟叶的利用。并且，随着电子烟市场的逐渐开发，对高烟碱含量烟叶的需求不断加大。本研究对烟碱合成及转运基因对烟碱积累贡献的差异进行分析，研究结果可为早期高烟碱品种的分子选育提供可用的基因资源，也为烟草叶片的烟碱积累调控提供理论指导。

4 结 论

不同烟碱相关基因对烟碱增量的贡献程度不同。叶部NtJAT1、NtQPT、NtGEF 是影响烟碱积累3个主要基因，且NtJAT1是叶部影响烟碱转运的主要基因。根部NtPMT、NtNUP1、NtJAT1、NtMATE1/2、NtGEF 5个基因影响烟碱积累，其中烟碱合成基因NtPMT对烟碱增量影响最大，且NtNUP1是根部最主要的烟碱转运基因。囊泡运输调节因子NtGEF在叶部和根部对烟碱积累都有影响。

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