基于SLAF—seq技术的烟草抗CMV主效QTL定位

潘旭浩 程立锐 陈小翠 蒋彩虹 任民 杨爱国

摘 要：烟草花叶病（CMV）是烟草主要病害之一，筛选与CMV抗病QTL紧密连锁的分子标记是烟草抗病分子育种的重要部分。本研究以抗病材料台烟8号和感病材料NC82为亲本，获得BC1群体，构建抗、感池。采用BSA和SLAF-seq技术开发CMV抗病相关SNP分子标记，共获得180 370个SLAF标签，经分析后获得6156个多态性SNP标记。利用SNP-index分析方法，发现两个与CMV抗病高度关联的区域。利用这些分子标记成功定位到了两个CMV抗病相关QTL，其中一个QTL定位于Chr01上的55.72 ～60.44 Mb区间内，区间大小为4.72 Mb；另一個则定位于烟草Chr18上的44.21～48.70 Mb区间内，区间大小为4.49 Mb。在关联到的QTL区间内设计分子标记可以用于烟草抗CMV育种的辅助选择。

关键词：烟草；CMV抗性；QTL；SALF-seq

中图分类号：S572.03 文章编号：1007-5119（2018）05-0001-08 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2018.05.001

Abstract： Cucumber mosaic virus （CMV） is one of most important diseases in tobacco， and selection of molecular markers closely linked to CMV resistant QTLs is a key for tobacco CMV-resistance breeding. In order to identify genes closely linked to CMV resistance and develop resistant varieties， a BC1 population derived from resistant-parent Taiyan-8 and susceptible-parent NC82 was used to construct resistant and susceptible pools. By application of BSA and SLAF-seq technique， a total of 180，370 SALF labels were obtained and 6，156 polymorphic SNP markers were developed. As a result， two CMV-associated regions were identified by analysis of SNP-index data. Our results showed that abundant polymorphic SNPs can be developed between tobacco varieties using SALF-seq. By utilization of these SNPs， two CMV-resistance QTLs were successfully identified in Chr01 and Chr18， with 4.72 Mb and 4.49 Mb interval， respectively. The two identified QTLs are useful for in molecular marker assisted selection in tobacco breeding programs for CMV resistance.

Keywords： tobacco； CMV resistance； QTL； SLAF-seq

黄瓜花叶病毒病（Cucumber mosaic virus，CMV）是一种病毒性病害，在烟草中主要经由蚜虫或汁液摩擦进行传播，感病后主要表现为烟叶花斑、叶片卷曲，严重时直接影响烟株发育，导致烟叶产量、质量下降。其流行速度快，发生范围广，是我国发生最为普遍、危害最大的烟草病害之一。目前生产上对烟草CMV防治主要还是以化学防治为主，不仅浪费人力，增加种植成本，而且对于环境也会造成不利的影响，因此，培育CMV抗病品种一直被认为是防治CMV的有效手段。但是由于烟草CMV抗性由多基因控制[1]，高抗病的种质资源缺乏，通过常规育种手段选育抗病品种的耗时长，效果差。

因此开发与抗病基因紧密连锁的分子标记，通过分子标记辅助育种可以加快培育烟草抗CMV品种的进程，提高育种效率。

前人关于CMV抗病的研究多集中在辣椒[2-3]、黄瓜[4-5]等作物上。由于烟草遗传背景狭窄[6]，可利用的传统分子标记数量少，多态性差，关于烟草CMV抗病QTL（Quantitative trait loci，数量性状基因座）的研究较为滞后。目前，仅有少量与烟草CMV抗病QTL相关的文献发表，范静苑等[7]构建了烟草BC1群体，并基于混合群体分组分析法（BSA）对CMV抗病基因进行了初步定位，获得了两个和CMV抗性基因连锁的标记SM1350和SM2270；文柯等[1]在烟草上对BC1群体进行QTL基因定位，找到了一个与抗性QTL紧密连锁的标记53 735，遗传距离为0.1 cM，该QTL位于10号连锁群，贡献率为13%。

目前发表的烟草抗CMV分子标记无论从数量还是准确性上，离实际应用分子标记进行辅助育种仍有很大距离。简化基因组测序（Specific Length Amplified Fragment Sequencing，SLAF-seq）技术是以生物信息学为基础的高度自动化高通量测序技术[8]，其具有可重复性高，测序时间短，获取信息量大，可利用多态性SNP标记多等重要特点，可以有效克服烟草遗传背景狭窄，传统多态性标记缺乏的缺点，利用该技术有望对烟草CMV抗病基因进行精细定位。

本研究在前人研究基础上，基于390个BC1单株接种CMV后鉴定结果，构建抗病池和感病池，利用SLAF-seq开发大量SNP多态性标记，获得CMV主效QTL位点，定位了这些位点在烟草染色体上的位置，为烟草抗CMV分子标记开发以及抗病育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试亲本及群体：抗病亲本为台烟8号（P1），感病亲本为NC82（P2），两个亲本杂交后F1代与台烟8号回交，获得包含390个单株BC1群体作为供试群体。

供试材料无性扩繁：利用P1、P2、F1、BC1群体材料单株的叶片进行组织扩繁、无性繁殖，每个单株均获得与之基因组完全一样的家系材料，这些家系材料用于接种CMV，调查病情，家系的病情即代表扩繁前的单株病情。

毒源：用于接种鉴定烟草CMV的毒源为中国农业科学院烟草研究所病虫害综合防治中心提供的CMV-C（普通株系），在使用前15 d进行复壮以防止保存期病毒致病性发生变异。

1.2 群体接种、病情指数鉴定及群体病级方差分析

对供试BC1群体CMV抗性鉴定在中国农业科学院烟草研究所青岛即墨基地温室进行。取经过复壮的携带CMV病毒的枯斑三生烟叶于研钵，加少许石英砂和磷酸缓冲液，研磨充分，双层纱布过滤，然后按终体积比1：5加入磷酸缓冲液定容。在烟苗真叶期时，选择充分展开的第4～5片真叶，在叶面上均匀撒400～500目的石英砂，用脱脂棉球蘸取病毒水溶液轻轻摩擦1～2遍进行接种，尽量保证每片叶接种力度、深度的一致性，接种后立即用水冲洗叶面。在第1次接种5 d后进行第2次摩擦接种，两次接种力度保持一致。

分别在第2次接种后14～20 d以及20～27 d进行CMV病害调查，并计算病情指数。依据烟草病虫害分级及调查方法GB/T 23222—2008进行，病毒病分级标准，以株为单位，分0级，1级，3级，5级，7级，9级共六个级别，分别为：

0级：全株无病。

1级：心叶明脉或轻微花叶，病株无明显矮化。

3级：1/3叶片花叶但不变形，或病株矮化为正常株高的3/4以上。

5级：1/3至1/2叶片花叶，或少数叶片变性，或主脉坏死，植株矮化为正常株高的2/3至3/4。

7级：1/2至2/3叶片花叶，或变形，或主侧脉坏死，或植株矮化为正常株高的1/2到2/3。

9级：全株叶片花叶，严重变形或坏死，病株矮化为正常株高的1/2以上。

病情指数=100×∑（各级病叶数×各级代表值）/（调查总叶数×最高级代表值）。群体抗性分类标准：免疫（病情指数等于0，无侵染）；高抗（0<病情指数≤15）；中抗（15<病情指数≤30）；中感（30<病情指数≤50）；高感（50<病情指数≤100）[9]。

利用SPSS軟件对BC1群体病级进行单因素ANOVA分析，以确定群体内单株抗病性差异是否显著。

1.3 群体DNA提取及抗感基因池构建

对所有材料台烟8号、NC82、F1及BC1群体用植物基因组DNA提取试剂盒进行单株提取，为了保证提取的浓度和纯度，本法略微有所改进：根据人工CMV接种及鉴定的结果，从BC1分离群体中选取极端抗病株与极端感病株各52个建立抗感基因池，每个家系样品根据所测的DNA原始浓度进行等质量混样，保证所加入的DNA样品总量相等，抗池标为R-bulk，感病标为S-bulk。

1.4 基于SLAF-seq技术的QTL定位

根据酶切预测软件（SLAF_Predict）进行烟草基因组酶切预测，本研究采用SspI和HaeIII进行酶切消化；37 ℃酶切15 h，反应结束后用QIAGEN试剂盒纯化，50 ?L EB 回溶；在20 ℃反应体系下，加入总体系为100 ?L的酶切DNA片段、ddH2O、dNTPs mix、T4 DNA polymerase、Klenow DNA polymerase、T4 PNK，反应30 min进行5'末端磷酸化修饰；随后在20 ℃反应条件下，加入Klenow 片段和dATP，在酶切片段的3'端加上单核苷酸A，利用T4连接酶将Duplex测序接头连接在3'端加单核苷酸A的酶切片段上，反应结束后QIAGEN试剂盒纯化，10 ?L EB回溶；在20 ℃反应条件下，将上一步纯化产物同时加入DNA ligase buffer 2X、Adapter oligo mix以及DNA ligase反应15 min，反应结束后用QIAGEN试剂盒纯化，30 ?L EB回溶；上一步纯化的产物用2%琼脂糖凝胶电泳60 min，电压为120 V； 切取464～494 bp目的片段利用QIAGEN试剂盒纯化后将产物稀释，利用Illumina high-throughput sequencing platform（Illumina， Inc； San Diego， CA， U S）进行双端测序。通过评估Control日本晴测序数据监控实验过程是否正常，并对序列的reads双端比对效率、酶切效率、CG含量以及Q20进行分析，评估测序质量。

基因组经酶切处理打断为无数小片段，每个片段相当于一个标记位点，同一位点reads序列通过相似性聚类，形成一个group。一个group中一般存在1～4条高深度片段，其余全为低深度片段。对测序得到的各样品的reads数据进行评估，通过相似性聚类、基因型纠错后，再定位到基因组上，得到SLAF标签，对SLAF标签进行多态性分析，得到样品间的多态性SNP标记。根据得到的多态性标记以及抗池、感池的CMV表型鉴定结果进行关联分析，将CMV主效QTL位点定位在烟草染色体上。

2 结 果

2.1 供试群体无性繁殖

经过无性繁殖培养得到无菌苗台烟8号40棵、NC82 40棵、F1 40棵以及BC1群体800棵。在无性扩繁过程中，排除掉家系内新苗大小不一致，或因污染、分化数不够等情况，共筛选出烟苗长势一致，家系内植株数5株以上的BC1家系452个，共7362个单株，平均每个BC1家系16株。

2.2 BC1无性繁殖家系CMV抗病鉴定与遗传分析

在植株5～6叶期时进行两次幼苗摩擦接毒，在接种后第20～25天进行抗病鉴定，结果发现（图1）：抗性亲本台烟8号，接种CMV后无明显感病症状；感病亲本NC82在完全感病后表现为叶面花叶、疱斑严重，叶片畸形呈柳条状、镰刀状，叶缘底部椭圆而叶尖细长，植株矮化、纤弱；F1大部分表现出花叶、畸形等感病症状（图1）。BC1群体材料则表现出分离，部分植株表现为抗病，部分植株表现为感病，而多数植株发病表现介于两个亲本之间（图2）。为减小CMV抗病鉴定中的人为、环境误差，BC1群体每个单株均构建了无性繁殖家系，通过群体单株家系的平均抗、感病表现，计算群体单株的病情指数，最终对390个BC1群体家系进行了鉴定分析，结果表明，台烟8号病情指数介于10～15之间；NC82病情指数在30～50。BC1群体中，约78个家系病情指数小于15，鉴定为抗病，206个家系病情指数在15～30，鉴定为中抗，约106个家系病情指数大于30，鉴定为感病。BC1群体CMV抗病性状整体呈现连续分布，因此说明抗病亲本的CMV抗性由多基因控制，为数量遗传性状（图2）。BC1群体病级方差分析结果表明（表1），群体内单株间病级指数存在极显著差异。

2.3 BC1群体抗、感池构建

根据BC1群体获得CMV病情指数进行抗、感

池构建：选取的原则是单株家系数量大于等于5，且抗池病情指数小于15，感池病情指数大于33.33。根据单株DNA的检测浓度进行等质量混样，混样数为抗、感池各52个样品。经检测P1、P2、R-bulk和S-bulk 的浓度均大于50 ng/?L，OD260/280在1.8～2.0之间，OD260/230大于2.0，表现单峰，无色素和蛋白质污染，检测结果合格。琼脂糖电泳检测DNA完整性高（图3）。

2.4 酶切效率统计与建库评估

序列的reads双端比对结果显示，Control日本晴水稻在本次实验双端比对效率为74.94%，比对效率正常；Control数据的酶切效率E-ratio为96.54%，酶切反应良好[10]；根据酶切体系，通过Control评估所有测序reads的插入片段，绘制所有reads的插入片段分布图，并估测实际的切胶范围，本实验Control测序数据的插入片段大部分都分布在450～550 bp，插入片段的中心值为482 bp（图4）。综上所述，文库构建正常。

2.5 测序数据统计与评估

对已构建的BC1群体抗、感池以及两个亲本进行SLAF-seq全基因组测序，采用Q20检测和碱基分布检查的方法对测序结果进行评估和过滤以保证后期的分析质量。测序结果显示，试验总共得到54.4 Mb测序reads，总数据量为8.7 Gb；其中台烟8号作為抗性亲本有效reads 13 854 896个，NC82作为感性亲本有效reads为9 139 744个，感池S-bulk有效reads为16 321 266个，抗池R-bulk有效reads为15 023 916个。试验的碱基质量主要集中在20～40之间，即测序错误率在0.01%～1%，能够保证后面的多态性分析和关联分析。测序获得平均GC 含量为32.93%（表2），GC含量均较低，说明达到测序要求。

2.6 SNP标记开发及抗CMV主效QTL位点定位

本试验获得有效SLAF标签数为180 370个。对得到的180 370个SLAF标签，根据等位基因数和基因序列之间的差异进行多态性分析，共得到SNP、INDEL、No Polymorphism和Repeat 4种SLAF标签，其中SNP和INDEL统称为多态性标记。本次分析共得到6156个多态性标记且均为SNP标记，多态性比例为3.41%（表3）。

SNP-index方法计算关联值，并采用SNPNUM方法对△SNP-index 进行拟合，取每个SNP附近200个SNP 的△SNP-index的中值作为该位点拟合后的关联值。根据计算机模拟实验计算[11]结果，发现与CMV抗性性状关联的SNP标记主要集中在两个区间之内：其中一个QTL定位于烟草Chr01上的55.72～60.44 Mb区间内，区间大小为4.72 Mb；另一个则定位于烟草Chr18上的44.21～48.70 Mb区间内，区间大小为4.49 Mb。

利用茄科基因组数据库（https：//solgenomics. net/organism/Nicotiana_tabacum/genome）对两个区间进行基因预测。在Chr01的4.72 Mb区间内有34个基因，其中有20个基因功能已被注释；在Chr18的4.49 Mb区间内有41个基因，其中有31个基因功能已被注释。经初步分析，两个区间内均存在锌指蛋白家族基因，该基因家族成员可能与烟草CMV抗性相关。

3 讨 论

分子标记辅助育种技术可以大大提高作物育种效率[12]。在早期的研究中，SSR标记因其稳定、可靠、易操作的特点，成为在连锁作图、QTL定位中应用最为广泛的标记[13]。但是，由于烟草本身遗传背景狭窄，标记多态性差，使得SSR标记在烟草抗病基因QTL定位研究中利用难度大、效率低、效果差。目前，SLAF-seq技术在单体型图谱绘制、遗传图谱绘制、关联性图谱绘制和多态性图谱绘制等方面的应用已有大量成功案例，利用SLAF技术和BSA进行SNP开发及QTL定位的研究已在拟南芥[14]、黄瓜[15]、甘蓝型油菜[16]等不同植物上有相关报道。利用SLAF技术可以在短时间内获得遍布整个基因组的海量多态性SNP标记，从而实现对目标QTL的精细定位。

本研究结合BSA方法，构建了BC1群体以及其群体单株无性繁殖家系，通过对BC1群体单株家系CMV抗病性的鉴定获得了较为准确的抗病表型数据，并构建抗、感病极端混池。利用SLAF-seq技术获得了覆盖全基因组SLAF标签数为180 370个，经筛选其中多态性SNP标记共6156个，多态性比率为3.41%。

与SSR标记进行比较，牟建英[17]以白粉病抗感材料为亲本筛选了2317对SSR引物，得到61对多态性标记，多态性比率仅为2.6%；高亭亭等[18]利用2653个SSR标记对烟草黑胫病抗感亲本进行全基因组筛选，共得到184对多态性引物，多态比率为6.9%；WU等[19]利用1376对SSR引物对白秆突变体及HD之间进行全基因组筛选，最终仅获得96个在全基因组均匀分布的SSR多态性标记，多态比率为6.9%；而目前密度最大的烤烟SSR标记遗传连锁图仅含覆盖24个连锁群的611个SSR标记[20]。从多态性比率来看，本研究中SNP标记多态性比率与SSR标记差别不大，这进一步验证了烟草遗传背景狭窄、标记多态性差的结论。但是由于开发的SNP标记基数大，覆盖密度高，与前人研究进行对比，本研究中通过SLAF-seq技术获得的烟草多态性SNP标记数量是常规SSR标记的几十倍甚至上百倍，有效地克服了SSR标记在烟草研究上的缺点，为烟草CMV抗病QTL定位提供了有力的技术保证。

一般来说，在构建连锁图谱进行基因定位的研究中，标记覆盖的连锁群越全，连锁群上标记密度越大，定位效果越好，反之则定位QTL可靠性、可用性就会降低。在烟草CMV抗病QTL研究中，文柯[1]利用SSR标记对烟草CMV抗性进行定位，在该研究中63个标记仅覆盖了11个连锁群，其中标记最多的连锁群仅有8个标记，而有5个连锁群仅由2个标记构成；在烟草其他病害QTL定位中，TONG等[21]利用2000多对SSR标记对烟草赤星病进行定位，从中筛选出了覆盖24个连锁群的181个多态性标记，平均每个连锁群标记数为7.54个；LAN等[22]在对烟草青枯病的研究中，利用201个SSR标记构建了24个锁链群，平均每个连锁群标记数8.37个。而在本研究中，利用分布于全部24个连锁群的6156個SNP多态性用于CMV抗病QTL定位，平均每条染色体多态性标记达到256.5个。

从CMV抗病QTL定位结果来看，文柯利用SSR标记找到了一个与CMV抗病相关的QTL并将其定位在10号连锁群上，10号连锁群仅含有2个SSR标记53 735和54 169，标记之间间距为13.41 cM；在本研究中，我们发现了两个CMV抗病QTL，其中一个QTL被定位于Chr01染色体的4.72 Mb区间内，另一个被定位于Chr18染色体的4.49 Mb区间内。本研究相较前人研究定位了两个抗CMV主效QTL，这也与烟草CMV受多基因控制的结论更吻合，同时这两个QTL定位区间也更小，为进一步基因精细定位与克隆打好了基础。本研究结果充分说明在烟草上利用SLAF-seq技术开发SNP标记进行基因定位比SSR标记更为可靠、高效。

本研究进一步对Chr01和Chr18染色体上定位QTL区间内包含的基因进行分析，发现在Chr01的4.72 Mb区间内共有34个基因，发现其中有14个基因功能未知，其余20个基因功能已被注释；在Chr18的4.49 Mb区间内共有41个基因，其中有10个基因功能未知，另外31个基因功能已被注释。对已注释基因的功能进行分析发现，在两个区间内均发现锌指蛋白（Zinc finger）家族基因，其中在Chr01区间内的有两个锌指蛋白家族基因，它们分别为C3HC4类型和C2C2类型；而在Chr18区间内也有两个锌指蛋白基因，均为C2H2类型。锌指蛋白是一个庞大的转录因子家族，其功能主要是调控基因表达[23]，根据锌指蛋白保守基序特点，可以将其分成9大类，而C2H2、C3HC4、C2C2便是其中主要的3种类型[24]。前人关于锌指蛋白的研究主要集中在植物发育和非生物胁迫上，而抗病方面的研究目前还处于起步阶段，但是根据前人有限的报道，这3种类型的锌指蛋白均有家族成员与植物抗病功能相关。其中，C2H2和C3HC4家族基因中已有其与CMV抗性相关的报道，如烟草ZFT1基因在感染烟草花叶病毒后也会受到不同程度地诱导，激起敏感应答[25]；而拟南芥STZ基因感染黄瓜花叶病毒，同样诱导过敏反应[26]；水稻锌指蛋白基因OsBIRF1过表达载体转入烟草后，转基因烟草增强了对烟草花叶病毒、野火病菌和烟粉虱的抗性，防御相关基因的表达水平也升高了[27]；除此之外C2C2类型基因如OsLOL2有报道称过表达该基因可提高水稻对稻瘟病的抗病性[28]。因此，本研究初步预测上述4个锌指蛋白基因可能就是参与烟草CMV抗病调控的候选基因。在本研究基础上，进一步开展抗病基因克隆及基因功能验证并开发分子标记，对于阐明烟草与CMV病毒间的互作机制和CMV抗病分子标记辅助育种具有重要意义。

4 结 论

利用SLAF-seq技术对CMV抗、感亲本及后代群体进行简化测序，开发了覆盖24个连锁群的6156个多态性标记，对BC1 群体抗病表型及基因型进行连锁分析，找到了两个与CMV抗性紧密连锁的QTL，分别定位于染色体Chr01的4.72 Mb以及Chr18的4.49 Mb区间内，本研究获得的两个抗病QTL为烟草CMV抗病分子育种提供了重要的理论依据。

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