基于液质联用法同时检测龟甲胶饮片中牛皮源、驴皮源及龟甲胶成分

郝刚，罗丹，钟水生

（1.苏州市药品检验检测研究中心，江苏 苏州 215104；2.浙江省人民医院药学部，浙江 杭州 310014）

龟甲胶作为常见的胶类药材，具有滋阴、养血、止血等功效，常用于阴虚潮热、骨蒸盗汗、腰膝酸软、血虚萎黄、崩漏带下等症状[1]。龟甲来源主要为龟科动物乌龟（Chinemys reevesii）的背甲及腹甲，然而目前市场上龟甲胶质量参差不齐，某些非法生产企业为追求经济效益，采用牛皮、驴皮等其他动物皮类制成龟甲胶，不仅为人民群众安全用药带来危害，也为传统药材的质量标准研究提出挑战[2-6]。本实验基于超高效液相色谱-串联四级杆质谱技术（UPLC-MS/MS）建立了同时检测龟甲胶饮片中牛皮源、驴皮源及龟甲胶等成分的测定方法，实现龟甲胶饮片中主成分鉴别与非法添加成分检查的同时测定。

1 材料

1.1 仪器

Waters公司超高效液相色谱-串联四级杆质谱（仪器型号：ACQUITY Xevo TQ-S）；电喷雾离子源（ESI＋），Masslynx 4.1数据处理系统；KQ-300DA型数控型超声波清洗器；Thermo低温离心机；MILLIPORE纯水仪。

1.2 样品与试剂

龟甲胶对照药材（批号：121693-201301），黄明胶对照药材（批号：121695-201301）， 阿胶对照药材（批号：121274-201202）均购自中国食品药品检定研究院；序列分析级胰蛋白酶购自Sigma-Aldrich公司（批号规格：T1426-50 mg）；实验用水为超纯水，其他试剂均为色谱纯。供试品龟甲胶饮片均来源于市场监督抽样。

2 方法与结果

2.1 质谱条件

电喷雾离子源（ESI）；正离子扫描；毛细管电压3.0 kV；毛细管温度：200℃；脱溶剂气体流量：500 L/h；锥孔气流量：150 L/h；氩气为碰撞气；采用多反应检测模式（MRM）监测，以质荷比（m/z）631.3（双电荷）→546.4和（m/z）631.3（双电荷）→921.4作为龟甲胶特征肽段离子对；（m/z）641.3（双电荷）→726.2和（m/z）641.3（双电荷）→783.3作为牛皮源特征肽离子对；（m/z）539.8（双电荷）→612.4和（m/z）539.8（双电荷）→924.0作为驴皮源特征肽离子对。

2.2 色谱条件

BEH-C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流动相：以乙腈为流动相A，0.1%甲酸溶液为流动相B，按表1方法进行梯度洗脱；柱温：20℃；进样器温度：15℃；流速：0.3 mL/min；进样量：1 μL。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

2.3 溶液制备

龟甲胶、黄明胶、阿胶对照药材溶液制备：分别取龟甲胶、黄明胶、阿胶对照药材0.1 g，置于50 mL容量瓶中，加1%碳酸氢铵溶液超声溶解并稀释至刻度。混合对照溶液制备：分别取黄明胶对照药材溶液、阿胶对照药材溶液5 mL，置100 mL容量瓶中，加龟甲胶对照药材溶液稀释至刻度，过0.22 μm滤膜，取续滤液100 μL，加胰蛋白酶溶液10 μL（取序列分析级胰蛋白酶，加1%碳酸氢铵溶液制成1 mg/mL的溶液，临用新配），摇匀，37℃恒温酶解12 h，进样分析。

供试品溶液制备：取龟甲胶饮片打粉，精密称定粉末0.1 g，置于50 mL容量瓶中，加1%碳酸氢铵溶液超声溶解并稀释至刻度，过0.22 μm滤膜，取续滤液100 μL，加胰蛋白酶溶液10 μL，摇匀，37℃恒温酶解12 h，进样分析。

2.4 方法专属性

按上述质谱方法和色谱条件检测龟甲胶、黄明胶、阿胶混合对照溶液，MRM质谱如图1所示，黄明胶对照品药材保留时间为3.6 min，阿胶对照药材保留时间为6.03 min，龟甲胶对照药材保留时间为8.24 min。空白基质溶液如图2所示，结果表明，空白基质溶液在龟甲胶、黄明胶、阿胶保留时间处无干扰。

图1 黄明胶、阿胶、龟甲胶对照药材溶液特征离子色谱图

图2 空白基质溶液色谱图

龟甲胶（图3）、阿胶（图4）、黄明胶（图5）对照品药材溶液分别进样，实验结果表明，在所建方法中，任一对照药材对其他2种对照药材的检测均无干扰，3种对照药材的特征肽离子对专属性良好。

图3 龟甲胶对照药材溶液特征离子色谱图

图4 阿胶对照药材溶液特征离子色谱图

图5 黄明胶对照药材溶液特征离子色谱图

2.5 检测限

龟甲胶、黄明胶、阿胶对照药材溶液逐级稀释，以各自特征肽离子对色谱图信噪比3∶1计算检测限，结果表明，龟甲胶检测限浓度为0.5 mg/L，黄明胶检测限浓度为2.0 mg/L，阿胶检测限浓度为1.0 mg/L。

2.6 重复性

取龟甲胶、黄明胶、阿胶对照药材混合溶液6份，按所建方法进行检测，分别计算3种对照药材MRM色谱峰面积，龟甲胶峰面积RSD为3.8%，黄明胶峰面积RSD为4.5%，阿胶峰面积RSD为2.7%，结果表明所建方法重复性良好。

2.7 样品测定

收集市场常见品牌的龟甲胶饮片18批，按本实验所建方法对样品进行检测。检测结果表明，全部批次样品检出龟甲胶特征肽离子对，即符合《中华人民共和国药典》（2015年版）鉴别项下相应规定。其中3批样品检出牛皮源成分，全部样品未检出驴皮源成分（或低于检测限）。

3 讨论

UPLC-MS/MS具有分离能力强，分析时间短及高选择性、高灵敏度等优势，近年来被广泛应用于药品质量标准研究[7-9]。《中华人民共和国药典》（2015年版）首次将液质联用技术应用于胶类药材的标准检验，规定以质荷比（m/z）631.3（双电荷）→546.4和（m/z）631.3（双电荷）→921.4作为龟甲胶的特征肽段离子对，从而应用于龟甲胶的鉴别[1]。此外，国家食品药品监督管理总局于2014年7月17日发布了“龟甲胶中牛皮源与驴皮源成分检测”的补充检验方法（编号：2014013），规定龟甲胶中不得检出牛皮源特征肽离子对[（m/z）641.3→726.2和（m/z）641.3→783.3]及驴皮源特征肽离子对[（m/z）539.8→612.4和（m/z）539.8 → 923.8][10]。

本实验基于UPLC-MS/MS方法，建立了同时检测龟甲胶饮片中龟甲胶、牛皮源和驴皮源成分的测定方法，所建方法可专属性检测龟甲胶、黄明胶、阿胶的特征肽离子对，且互无干扰，3种对照药材的方法检测限均在0.5～2.0 mg/L范围内，方法灵敏度高，满足龟甲胶饮片中牛皮源、驴皮源成分的“掺假”检查。此外，所建方法将药典的龟甲胶鉴别方法与补充检验方法中驴皮源、牛皮源成分检查方法相结合，实现了龟甲胶、牛皮源、驴皮源等成分的同时测定，进一步缩短了分析时间，提高检测效率，且方法重复性好，可用于实际样品测定，为龟甲胶饮片的质量控制提供了实验依据。

参考文献

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[10]国家食品药品监督管理总局,药品检验补充检验方法和检验项目批准件2014013[S].北京,2014.