Wnt/β⁃catenin信号通路在肾缺血再灌注大鼠中的表达及ICG⁃001阻断对慢性肾间质纤维化的作用

黄健 刘畅 陈松 闵亚丽

贵阳市第一人民医院肾内科（贵阳550002）

肾缺血再灌注损伤（IRI）是在肾组织缺血基础上恢复血液灌流后肾脏功能不能得到有效恢复，甚至出现不可逆的肾脏功能损害，是多种肾脏疾病发展的重要环节。IRI的损伤机制较复杂，有多重信号通路参与调控，其发病机制尚未完全清楚，目前尚未发现很有效的干预措施。有研究发现IRI引起急性肾损伤时Wnt/β⁃catenin信号通路被激活，并可能参与了肾小管上皮细胞的修复［1］，而Wnt/β⁃catenin信号通路在IRI致慢性肾间质纤维化的研究甚少。本研究观察不同时间Wnt/β⁃catenin信号通路在IRI致肾小管间质纤维化大鼠中的表达，并用β⁃catenin的小分子抑制剂ICG⁃001阻断Wnt/β⁃catenin信号通路，观察肾脏的病理变化，探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物模型的建立和分组选用雄性SD大鼠28只（购自贵州医科大学动物实验中心），随机分为Sham组、IRI 7 d组、IRI 14 d组、ICG+IRI组（n=7）。以5%戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔麻醉。IRI 7 d、IRI 14 d组及ICG+IRI组游离后用无创血管夹夹闭左侧肾动脉，35 min后去除血管夹，缝合伤口。Sham组游离左侧肾动脉但不夹闭。ICG+IRI组于术后第2天开始腹腔注射ICG⁃001［5 mg/（kg·d），上海佰世凯］。IRI 7 d组术后6 d切除右肾，术后7 d处死大鼠；其余3组大鼠术后13 d切除右肾，术后14 d处死大鼠。处死前腹主动脉取血，分离血清。留取左肾组织部分置于4%甲醛溶液固定，部分放入-80℃低温冻存冰箱。

1.2 肾功能测定全自动生化仪测定血清肌酐浓度。

1.3 生化染色法检测采用天狼猩红/快速绿色胶原染色试剂盒（Chondrex Inc）检测胶原含量。10 μm厚冰冻切片，按试剂盒说明书操作，计算胶原量所占百分比。

1.4 肾脏组织学检查肾组织经10%中性缓冲甲醛过夜，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片（厚度3 μm）后，Masson染色分析。

1.5 肾脏免疫组织化学采用ABC法检测β⁃catenin的表达。石蜡切片常规脱蜡，3%H2O2室温孵育10 min，浸入柠檬酸盐缓冲液微波修复20 min，牛血清封闭20 min，加β⁃cateninⅠ抗（Santa Cruz）4℃孵育过夜。Ⅱ抗孵育1 h后加入ABC复合物，暗室孵育30 min，冲洗后加入显色液，显色10～30 min，显微镜下观察，苏木素衬染，封片。

1.6 Western blot检测提取肾脏总蛋白并用BCA法进行蛋白质定量，每泳道30 μg蛋白，10%SDS⁃PAGE电泳分离后湿转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭后，分别加Tubulin（上海康成，1∶10 000）、多克隆鼠抗β⁃catenin（Santa Cruz，1∶2 000）、Fibro⁃nectin（Santa Cruz，1∶1 000）、α⁃SMA（Santa Cruz，1∶10 000），Ⅰ抗4℃孵育过夜。洗膜后，再加辣根过氧化酶标记的Ⅱ抗。用增强化学发光系统显色，并曝光于X光胶片上，计算机图像分析系统分析条带的相对吸光度值。

1.7 统计学方法用SPSS 12.0软件对数据进行统计学处理，所有数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK⁃q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清肌酐Sham组与IRI 7 d组肌酐差异无显著性（P＞0.05），IRI 14 d组肌酐明显高于Sham组与IRI 7 d组（P＜0.05），ICG+IRI组血清肌酐较IRI 14 d组降低（P＜0.05），见表1。

2.2 胶原含量Sham组与IRI 7 d组胶原含量无明显差异（P＞0.05）；与Sham组及IRI 7 d组相比，IRI 14 d组胶原含量明显增多（P＜0.05）；ICG+IRI组与IRI 14 d组相比胶原含量明显减少（P＜0.05）。见表1。

表1 4组大鼠血清肌酐、胶原的比较Tab.1 The comparison of serum creatinine and collagen in four groups ±s

表1 4组大鼠血清肌酐、胶原的比较Tab.1 The comparison of serum creatinine and collagen in four groups ±s

注：与Sham组相比，*P＜0.05；与IRI 7 d组相比，△P＜0.05；与IRI 14 d组相比，#P＜0.05

组别Sham组IRI 7 d组IRI 14 d组ICG+IRI组Scr（mg/dL）0.352±0.085 0.437±0.059 0.897±0.058*△0.634±0.088*#胶原（%）3.843±0.620 5.028±0.852 12.014±0.921*△7.952±0.519*#

2.3 肾脏组织Masson染色观察IRI 7 d组与Sham组相比无明显改变（P＞0.05）；IRI 14 d组肾小管上皮细胞肿胀，间质区增宽、部分胶原纤维沉积，少量炎性细胞浸润，肾间质纤维化。而ICG+IRI组与IRI 14 d组相比病理改变减轻（P＜0.05）。见图1。

2.4 β⁃catenin免疫组化Sham组β⁃catenin在肾间质只有少量表达。IRI 7 d组与Sham组相比β⁃catenin表达增多（P＜0.05）。IRI 14 d与IRI 7 d组相比，β⁃catenin在肾间质表达数量明显增多（P＜0.05）。ICG+IRI组与IRI 14 d组相比，β⁃catenin在肾间质表达数量明显减少（P＜0.05）。见图2。

图1 4组大鼠Masson病理改变（×400）Fig.1 The pathological changes in four groups（Masson Stain，× 400）

图2 4组大鼠免疫组化比较（×400）Fig.2 The immunohistochemical expression in four groups（× 400）

2.5 Western⁃blot测 Fibronectin、β⁃catenin、α⁃SMA的蛋白表达水平Sham组β⁃catenin、Fibro⁃nectin、α⁃SMA仅有微量表达。IRI 7 d组β⁃catenin较Sham组有所增高（P＜0.05），IRI 14 d组β⁃catenin较IRI 7 d组增高更加显著（P＜0.05）。Sham组与IRI 7 d组Fibronectin、α⁃SMA表达无显著差异。与Sham及IRI 7 d组相比，IRI 14 d组Fibronectin、α⁃SMA蛋白表达水平明显上升（P＜0.05）。与IRI 14 d组相比，ICG+IRI组β⁃catenin、Fibronectin及α⁃SMA蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）。见图3、表2。

图3 各组大鼠Fibronectin、β⁃catenin、α⁃SMA蛋白表达Fig.3 The expression of fibronectin，β⁃catenin and α⁃SMA in four groups

3 讨论

既往IRI的大部分研究集中在急性肾损伤，其致慢性肾小管间质纤维化的作用机制研究很少。较轻度的IRI会导致急性肾损伤，而重度的IRI则会出现肾间质成肌纤维细胞激活、细胞外基质沉积导致肾间质纤维化［2］。急性肾损伤有时可以通过适应性修复和再生完全恢复其结构及功能，但有时因适应不良导致病情进展成慢性肾脏病［3］。严重IRI所诱发的小管间质病变会进展为慢性小管间质纤维化，并伴随肾小管浓缩功能的下降和蛋白尿的发生［4］。避免肾小管间质损伤，防止不可逆病理损害的进展是临床急需解决的问题，近期研究发现还原型谷胱甘肽、七氟醚等处理对IRI肾脏有一定保护作用［5-6］。

表2 4组大鼠β⁃catenin、α⁃SMA、Fibronectin的蛋白水平比较Tab.2 The protein assessment of β⁃catenin，α⁃SMA and fibronectin in four groups ±s

表2 4组大鼠β⁃catenin、α⁃SMA、Fibronectin的蛋白水平比较Tab.2 The protein assessment of β⁃catenin，α⁃SMA and fibronectin in four groups ±s

注：与Sham组相比，*P＜0.05；与IRI 7组相比，△P＜0.05；与IRI 14组相比，#P＜0.05

组别Sham组IRI 7 d组IRI 14 d组ICG+IRI组β⁃catenin 0.425±0.124 0.783±0.087*1.153±0.142*△0.723±0.152*#α⁃SMA 0.589±0.096 0.686±0.054 1.997±0.125*△1.212±0.156*#Fibronectin 0.304±0.085 0.418±0.076 0.958±0.096*△0.627±0.088*#

尽管在正常成人肾脏是沉默状态，但在多种肾损伤中 Wnt/β⁃catenin 信号通路重新激活［7-8］。近来的研究发现Wnt/β⁃catenin信号通路在急性肾损伤中激活可以促进肾小管的修复及再生以保护肾脏，但其持续激活则有可能促进急性肾损伤向慢性肾脏病的进展［2，9］。本研究也发现IRI术后7 d肾间质纤维化尚不明显时，肾组织β⁃catenin即有增高，随着时间延长，术后14 d β⁃catenin增高更加显著，提示IRI致肾纤维化过程中Wnt/β⁃catenin信号通路激活，且早于肾间质纤维化出现之前。

本研究观察到：IRI术后14 d大鼠血肌酐明显升高，病理改变提示肾小管间质纤维化；Fibronec⁃tin、α⁃SMA的蛋白表达及胶原蛋白水平明显升高。用小分子抑制剂ICG⁃001阻断Wnt/β⁃catenin信号通路，β⁃catenin表达显著减少，Fibronectin、α⁃SMA的蛋白表达水平明显降低，胶原蛋白及血清肌酐水平也明显下降，肾小管间质纤维化的病理改变程度有所减轻。但在IRI所致的AKI到CKD的病程进展中Wnt/β⁃catenin信号通路何时出现从肾脏保护作用到致病作用的转化以及何时对该信号通路进行干预效果最佳尚缺乏多个时间点的连续性动态观察，我们在今后的研究中会进一步探讨。

总之，本研究观察到在IRI致慢性肾损伤的病程中，Wnt/β⁃catenin信号通路早于肾间质纤维化出现前就已激活，参与了慢性肾脏病的发生发展，诱导了肾小管间质纤维化。而用ICG⁃001阻断Wnt/β⁃catenin信号通路可以减轻IRI所致慢性肾间质纤维化，为临床上探索使用能抑制Wnt/β⁃catenin信号通路的药物以防治肾缺血再灌注致慢性肾纤维化提供了理论依据。

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