HPLC法测定毛蕊花糖苷原料药中主成分的含量

毛乐静， 霍仕霞， 谭 雪， 孔 征， 闫 明

(1新疆医科大学药学院， 乌鲁木齐 830011； 2新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所， 乌鲁木齐 830049)

毛蕊花糖苷又名类叶升麻苷、麦角甾苷，在植物中分布广泛，如肉苁蓉[1]、向日葵列当[2]、小叶丁香[3]等。毛蕊花糖苷为水溶性的苯乙醇苷类化合物，现代药理学研究表明毛蕊花糖苷具有抗衰老[4]、调节内分泌[5-6]、增强免疫力[7-8]、抗老年痴呆[9-10]等作用。本课题组前期研究已从新疆管花肉苁蓉中提取分离纯化得到了高纯度的毛蕊花糖苷原料药,本研究采用HPLC法测定原料药中毛蕊花糖苷含量，为毛蕊花糖苷原料药质量控制和开发利用提供依据，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1仪器CBM-20 AB型高效液相色谱仪(日本岛津)，SQP-224-1CN型电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)，SK 8210 HP型超声清洗器(上海冠特超声仪器有限公司)，SZ-93型自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)。

1.2试药毛蕊花糖苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号111530-201208)，甲醇(美国Sigma-Aldrich公司，批号20150511)，甲酸(天津市富宇精细化工有限公司，批号20140818),毛蕊花糖苷原料药(新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所实验室自制，批号20130228、20130311、20130323、20130405、20130417、20130426、20130511、20130520、20130526、20130611)。

2 方法与结果

2.1对照品溶液的制备称取毛蕊花糖苷对照品20 mg，置于25 mL容量瓶中，用流动相(甲醇-0.2%甲酸溶液= 35∶65)定容至刻度，摇匀，制成浓度为0.800 0 mg/mL的对照品溶液。吸取1 mL至10 mL容量瓶中，用流动相定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2供试品溶液的制备取毛蕊花糖苷原料药20 mg，置于100 mL量瓶中，用流动相定容至刻度，摇匀，制成浓度为0.200 0 mg/mL的供试品溶液。吸取5 mL至10 mL容量瓶中，用流动相定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3色谱条件采用BDS Hypersil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，检测波长：330 nm，流动相∶甲醇-0.2%甲酸水溶液(35∶65)，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃；在该色谱条件下，毛蕊花糖苷分离度大于1.5，理论板数大于3 000，与其他组分分离度良好。

2.4标准曲线的制备分别吸取“2.1”项下对照品溶液适量，制成毛蕊花糖苷浓度分别为0.004 6、0.009 3、0.018 5、0.037 0、0.055 5、0.074 0、0.111 0 mg/mL的溶液，按“2.3”项下方法测定，得毛蕊花糖苷标准曲线方程为：Y=20 767X-1 329.5，r=0.999 6，在0.004 6～0.111 0 mg/mL浓度范围内，毛蕊花糖苷的浓度与峰面积具有良好的线性关系。

2.5精密度试验取供试品(批号20130228)6份，按“2.2”项下方法制备，按“2.3”项下方法测定，得峰面积值分别为2 140 665、2 070 992、2 086 001、2 111 223、2 079 321、2 079 321、2 078 990，平均峰面积为2 094 532，RSD=1.3%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.6稳定性试验取“2.2”项下供试品溶液，在室温下分别放置0、1、2、4、6、8、12、24、36、48、72、96 h后，按“2.3”项下方法测定，得峰面积值分别为2 140 665、2 134 551、2 132 951、2 124 458、2 115 568、2 068 990，平均峰面积为2 119 514，RSD=1.2%(n=12)，表明供试品溶液在96 h内的稳定性良好。

2.7检测限及定量限试验吸取“2.1”项下对照品溶液，逐级稀释，当信噪比S/N为3时，其检测浓度为0.120 0 μg/mL；当信噪比S/N为10时，其定量限为0.375 0 μg/mL。

2.8回收率试验称取已知含量的样品(批号20130228)适量，共9份，分别置于100 mL容量瓶中，分别加入“2.1”项下对照品溶液适量，用流动相定容至刻度，摇匀，吸取5 mL至10 mL容量瓶中，加流动相溶解定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，按“2.3”项下方法测定，平均加样回收率为99.3%,RSD=1.0%,见表1。

表1 加样回收率试验结果(n=9)

2.9样品含量测定称取10批毛蕊花糖苷原料药，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下方法测定，毛蕊花糖苷原料药中毛蕊花糖苷的平均含量990 mg/g，见表2。

表2 样品含量测定结果

3 讨论

对毛蕊花糖苷原料药进行含量测定的过程中，首先选择的流动相参考了2015版《中国药典》[11]中肉苁蓉含量测定方法，但其分析时间长，需要梯度洗脱，样品峰过宽。本研究在其基础上加以改进，最终选择有机相与水相比例为35∶65行等度洗脱。该色谱条件下样品峰形好，理论塔板数高，分析时间短。通过HPLC法测定毛蕊花糖苷原料药的含量，旨在为毛蕊花糖苷原料药质控方法的建立奠定基础，并为后续工艺研究提供合格的原料药。

参考文献：

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[2] 曲正义,金银萍,孙成贺,等.RP-HPLC同时测定向日葵列当中苯乙醇苷类化合物crenatoside和类叶升麻苷[J].中国实验方剂学杂志,2014,20(10):87-89.

[3] 刘普,张创峰,邓瑞雪,等.高效液相色谱法同时测定小叶丁香不同部位中5种活性成分的含量[J].中国中药杂志,2011,46(24):1935-1937.

[4] 文彦丽,霍仕霞,张伟,等.毛蕊花糖苷的药理作用及药物代谢动力学研究进展[J].中国民族民间医药,2015,24(14):26-27,29.

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[6] 王洪权,王玉敏,崔其福,等.类叶升麻苷在体内诱导血红素加氧酶-1的表达[J].中国老年学杂志,2015,35(2):419-420.

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[9] 朴景华,蒲小平,马建,等.类叶升麻苷对东莨菪碱所致记忆获得性障碍的改善作用[J].中国药理学通报,2001,17(6):625-627.

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[11] 国家药典委员会.中华人民共和国药典 (一部)[S].北京:中国医药科技出版社,2015:135-136.