长链非编码RNA MALAT1在宫颈癌血清与组织中的表达差异

张 蕾， 胡尔西旦·尼牙孜， 迪丽达尔·斯地克， 赵化荣， 陈 瑞， 刘 攀， 张宋安， 张 洋， 叶建蔚， 包永星

(新疆医科大学第一附属医院肿瘤中心， 乌鲁木齐 830054)

宫颈癌是女性生殖系统肿瘤常见的肿瘤之一。我国每年宫颈癌新发病例占世界新发病例总数的1/5左右[1]。因此，预测宫颈癌新的标志物，以及阐明宫颈癌发生及转移的分子水平机制，是提高宫颈癌患者生存率的首要问题，同时在治疗前通过对肿瘤放射敏感性的检测评估放疗疗效是及其重要的，为选择合理而有效的治疗提供有力的依据。因而与放疗疗效相关的分子标志物研究广受关注。

长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是最近几年发现的一系列转录物，长链非编码RNA的长度一般都超过200nt，虽然它们不具有编码蛋白质的具体功能，但调节mRNA的 剪切、降解以及翻译等过程发挥着其重要的作用[2]。lnc RNA 也逐渐被认为是肿瘤的相关分子，可以作为恶性肿瘤新的标志物来研究。肺癌转移相关转录本1 (metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1) 在人类非小细胞肺癌中被首次发现，也是最早被发现的lncRNA 之一[3]。放疗抵抗组MALAT1表达明显高于放疗敏感组的表达量[4]。因此，本文旨在研究MALAT1 在宫颈癌中的表达及评价放疗疗效。

1 材料与方法

1.1一般资料选择2014年1月-2016年12月新疆医科大学第一附属医院就诊的70例宫颈癌患者宫颈活检组织标本及血清，本研究通过新疆医科大学第一附属医院伦理委员会的审查及批准。所有标本采集后迅速置于液氮中，然后保存于-80℃冰箱中备用。其中10例患者因组织标本不合格，患者未完成放疗及失访等原因不纳入研究，在本研究中实际参加统计分析的患者为60例，患者年龄40～70岁，平均55岁。所有患者未行手术，只接受化疗或放疗。所有患者都签署了知情同意书。所有患者随访48月，未能按时至门诊复查者采用电话问询。生存时间为入院日至死 亡或末次随访日的间隔(月数)，记录患者病情进展和生存状况。

1.2方法

1.2.1 治疗方法 放疗采用三维适形照射或调强照射(IMRT)，DT45～50 Gy/25f，盆腔大野放疗后行近距离放疗，36 Gy/6f。根据患者耐受情况同期给予1～2周期氟尿嘧啶+顺铂(FP)方案化疗，具体方案为：顺铂(PPD)75 mg/m2d 1～3 静点+ 氟尿嘧啶(5-FU)1 000 mg/m2持续24 h微量泵泵入。

1.2.2 评价标准 近期疗效判断按WHO实体瘤疗效评定标准，分为完全缓解(CR)：肿瘤完全消失，持续4 w以上；部分缓解(PR)：肿瘤缩小达50%以上；持续4 w；无变化(SD)：肿瘤缩小不足50%或增大<25%；恶化(PD)：肿瘤增大>25%或出现的病灶。放疗结束后4 w由肿瘤科2位副教授行盆腔检查及结合CT、B超影像学检查评估。总有效率(RR)=CR+PR。

1.2.3 实验材料及方法 RNA提取试剂Trizol、 PrimeScriptTM cDNA 逆转录试剂盒(本TaKaRa公司生产，货号：1770989)，SYBR Premix color实时定量PCR试剂盒(北京天根公司生产，货号：65677)，无水乙醇，三氯甲烷(氯仿)，异丙醇，DEPC原液(成都科龙化工生产)。组织及血RNA提取、cDNA逆转录及实时聚合酶反应：总mRNA提取，按照Trizol RNA提取试剂操作说明进行操作，Nanodrop测定mRNA的含量和浓度，保证RNA的完整性(OD260/280值在1.8～2.0视为纯度很高，一般浓度在1 000 ng/mL较准)。总mRNA按照TaKaRa公司逆转录试剂盒操作说明逆转录成cDNA。应用SYBR即时PCR试剂盒进行PCR，具体操作按照试剂盒说明进行。MALAT1及内参GAPDH引物序列如下：MALAT1,上游引物5′-GAATTGCGTCATTTAAAGCCTAGTT-3′；下游引物5′-GTTTCATCCTACCACTCCCAATTAAT-3′；GAPDH, 上游引物5′-TGTTGCCATCAATGACCCCTT-3′；下游引物5′-CTCCACGACGTACTCAGCG-3′。反应体系构成：体系中试剂、底物,实验室用量;DNA Eraser Buffrer,1.0 μL;GEraser,0.5 μL;Total,调整后，最终实验用量为300 ng;RNAase free H20,补充至总实验用量为6 μL。条件：温度37℃，时间4 min。以配对正常组织的CT值为标准计算MALAT1相对表达水平，应用2-△△ct表示。

从溶解曲线可以看出样品都己进入扩增的平台期，说明实验的反应条件设定是比较准确的。以GAPDH为内对照组，当反应结束后计算出对应的CT值，即每个反应管中荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数，每个反应管的CT值与改模板的起始拷贝数都呈对数关系，CT值越小则表示基因起始拷贝数量的数量越多，基因的表达量也随之越高，根据扩增曲线分别得到MALAT1和GAPDH的CT值，通过公示计算出其表达量。

1.3统计学处理采用SPSS 23.0 统计软件进行数据分析。MALAT1在宫颈癌组织中的表达水平与基本资料及各临床病例特征之间的分析采用卡方χ2检验，此外对MALAT1高表达和低表达2组之间差异有统计学意义的指标进行调整，进行多因素COX回归分析，观察表达水平与生存率之间的关系，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1MALAT1在宫颈癌组织中的表达与正常组织相比，MALAT1在肿瘤组织中存在高表达，差异有统计学意义(P<0.05)，同时检测患者血清中MALAT1表达，放疗前患者MALAT1表达高于放疗后血清中MALAT1表达(P<0.05)。

2.2MALAT1的表达与宫颈癌患者临床病理特征的关系在60例宫颈癌患者中36例肿瘤组织中的MALAT1呈低表达，24例肿瘤组织中的MALAT1呈现高表达；MALAT1的表达水平与淋巴结转移(P<0.05)，而与年龄、肿瘤分化程度、肿瘤分期、鳞状细胞癌抗原(SCC)指标等无相关性(P>0.05)，见表1。

2.3MALAT1的表达与宫颈癌近期疗效的关系CR

为16例，PR为 10例，SD为27例，PD为7例。24例MALAT1高表达的宫颈癌中CR为4例(16.7%)，PR的有2例(8.3%)。36例MALAT1低表达的宫颈癌中CR为12例(33.3%)，PR的有8例(22.2%)。MALAT1低表达的宫颈癌放疗疗效明显较高表达的好，2组疗效差异有统计学意义(P<0.05)，MALAT1的表达与宫颈癌的疗效呈负相关，见表2。

表1 长链非编码 RNA MALAT1 与宫颈癌临床病理特征的相关性

表2 MALAT1的表达与宫颈癌近期放疗疗效的关系

3 讨论

宫颈癌是世界妇女中最常见的恶性肿瘤之一，新疆是我国宫颈癌的高发区[5]。本研究通过对新疆地区宫颈癌患者的长链非编码RNA MALAT1的表达情况进行了统计学分析，因本研究样本量较少等原因，不能完全肯定长链非编码RNA的表达在组织与血清学之间有明显的差异，仍需进一步研究。

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年龄在宫颈癌预后中的影响目前尚不能确定，但年轻以及年老对于患者均是预后不利的因素，特别是在局部晚期宫颈癌，也有研究表明年轻患者比年老的预后要好[6-9]。MALAT1的表达与宫颈癌患者年龄无统计学意义(P>0.05)，即年龄不能作为影响宫颈癌患者的放疗疗效及预后的因素，也可能与本研究组资料中宫颈癌患者样本数较少有关。

同时对于中晚期患者，放化联合治疗使宫颈癌患者的预后得到了极大地改善，但是患者总的生存率没有得到显著的提高，主要原因是因为多数宫颈癌患者就诊时已经出现微转移。如何有效的提高患者的生存率及有效的改善患者的生存质量是所有研究者们共同关注的焦点。本研究在肿瘤分化程度、肿瘤分期、 SCC指标等方面也进行了统计学分析表明：

MALAT1高表达和低表达2组的淋巴结转移发生率差异有统计学意义(P<0.05)，对淋巴结转移情况进行调整再次进行COX回归分析显示:淋巴结转移是宫颈癌的独立预后影响因素(P<0.05)，其相对危险度为OR=4.742(1.338～16.806)。

Ying等[10]通过对50例宫颈癌组织标本和25例正常宫颈标本作对照，结果发现，MALAT1在宫颈癌患者中，抗辐射病例中的表达高于辐射敏感病例中的表达。但是目前国内外有关MALAT1与宫颈癌放疗疗效相关的研究还未常见，因此本研究在宫颈癌患者组织中MALAT1的表达与放疗疗效和生存率进行了统计学分析，结果发现MALAT1低表达的宫颈癌患者生存率高于高表达患者，并差异有统计学意义(P<0.05)。这表明MALAT1的表达水平与放疗疗效是有相关性的。

总之，本研究表明:lncRNA MALAT1在宫颈癌中是高表达的，在预测宫颈癌放疗疗效上起重要作用，早期识别对射线抵抗的高危病例，采取个体化治疗，可减少复发及转移，从而提高宫颈癌的疗效。

参考文献:

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