性别及年龄对原发性高血压大鼠炎症因子的影响

艾尼瓦尔·吾买尔, 阿布来提·阿布力孜, 帕提古丽·阿布拉， 阿迪力·阿不都热合曼, 周文婷, 邬利娅·伊明

(1新疆医科大学药学院药理学教研室， 乌鲁木齐 830011; 2新疆维吾尔医学专科学校， 新疆 和田 848000)

原发性高血压(EH)指循环动脉血压增高为主的临床综合症，是由多基因、多因素综合作用而导致的一种错综复杂的常见疾病，在高血压病的发生发展过程中，随着疾病的进展，靶器官逐渐受到损害可发生如血管重构、肾小球受损和心肌肥厚等严重的器官损伤，最终导致致命性的并发症[1-2]。EH的发病机制到目前为止仍在不断探索当中，除遗传因素、饮食因素、精神因素以及神经-内分泌机制外，炎症因素在EH的发生、发展以及转归中也扮演了极其重要的角色[3]。已有研究发现，高血压患者处于低度炎症状态，其血清炎症分子含量明显增加[4-6]。而一些大规模的前瞻性研究结果表明，炎症可能于高血压发生之前就存在，是高血压发病及预后的独立预测因素[7-8]。本文以6月龄和12月龄自发性高血压大鼠为研究对象，探讨性别及年龄因素对高血压大鼠炎症因子的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物80只原发性高血压大鼠(SHR)，6月龄和12月龄雌性雄性各20只，SPF级，由上海第二军医大学实验动物中心提供。实验期间，保持动物房室温在22℃左右，相对湿度70%左右，自动照明(12 h明，12 h暗)。动物自由饮水及进食。所有实验动物的使用，得到第二军医大学动物管理机构的同意，符合第二军医大学动物伦理委员会的管理准则。

1.2实验仪器与试剂MPA-大鼠尾动脉无创测压系统(上海奥尔科特生物技术有限公司)，超高速低温离心机(Eppendorf 公司)，FTC2000 实时荧光PCR 检测仪(加拿大枫岭公司)，数码凝胶图像处理系统(上海倍曼生物科技有限公司)。戊巴比妥钠(Sigma公司产品)。IL-6和TNF-α放射免疫分析试剂盒由北京北方雅生物技术研究所提供。焦炭酸二乙脂(DEPC)由Genview 公司提供；TRIzol, RNAse inhibitor TaKaRa, Oligd(T)18, dNTPS Takara, 10×PCR buffer Takara均由上海Sango生物工程公司提供。

1.3实验方法

1.3.1 大鼠血压的测定 大鼠清醒状态下，以尾动脉血压测定仪测定其收缩压。将大鼠置血压测定仪的恒温箱内加热至37℃，以尾套置于尾根部，将压力传感器置于尾部下方，记录大鼠尾动脉的搏动曲线。大鼠在此环境中稳定30 min，待尾动脉搏动明显时开始测定。连续测定6次取均数，连续测定2 d，以2 d测定值的均数为该动物的血压值(以收缩压>150 mmHg为筛选标准，低于此标准者剔除)。

1.3.2 血清的制备及炎症因子的测定 经尾动脉测压合格的SHR大鼠，腹腔注射戊巴比妥钠(45 mg/kg)麻醉动物，颈动脉插管取血2 mL注入试管中，待凝固后分离血清，4℃ 3 000 rpm离心5 min，取上清液-20℃保存，用放射免疫分析试剂盒测定血清TNF-α及IL-6的含量，测定方法按试剂盒说明书进行。

1.3.3 Real-time RT-PCR检测大鼠肾组织中炎症因子的mRNA水平 取各组大鼠肾组织100 mg在液氮中碾磨成粉状，加入1mL TRIzol试剂、酚/氯仿抽提和乙醇沉淀方法准备总RNA。所有试剂及耗材均为DNase, RNase-Free。应用紫外分光光度计检测RNA样品260 nm和280 nm处的吸光度(OD)，浓度=OD260 nm×40 μg/mL×稀释倍数；纯度=OD260 nm/OD280 nm(比值在1.8～2.0间为RNA纯度优良)。以2.0 μg总RNA为模板，在AMV逆转录酶作用下逆转录成cDNA，总反应体系25 μL。所得cDNA-20℃冻存。根据Genebank数据库中同源基因的序列的报道设计寡核苷酸引物，引物序列见表1。待测样品均作复管，每次实验均以不加模板的PCR体系作为阴性对照。反应条件为：94℃ 5 min(热启动)，94℃ 30 s(变性)，65℃ 30 s(退火)，72℃ 30 s(延伸)，40个循环。结果用MJ opticon monitor软件分析。基因表达水平用倍数变化来表示(2-ΔΔCt法)：基因表达量采用实验组/对照组=2-ΔΔCt，其中ΔΔCt=(Ct目的-Ct参比)实验-(Ct目的-Ct参比)对照。

表1 候选基因短片段引物序列

2 结果

2.1对血清炎症因子的影响雄性SHR(SHR-M)大鼠血清IL-6的含量明显高于同龄的雌性(SHR-F)大鼠，不论雌性还是雄性SHR-12m大鼠血清IL-6的含量均明显高于SHR-6m大鼠，结果见表2。SHR-6m血清TNF-α不存在性别差异，而雄性SHR-12m大鼠血清TNF-α的含量明显高于同龄的雌性大鼠，并随着年龄的增加，血清TNF-α明显增多。

2.2SHR肾组织中IL-6mRNA表达SHR-6m-F大鼠IL-6 mRNA的表达低于SHR-6m-M大鼠约53%(P<0.05)， SHR-12m-F大鼠IL-6 mRNA的表达低于SHR-12m-M约272%(P<0.05)。SHR-12m-M大鼠IL-6的mRNA的表达高于SHR-6m-M大鼠约242%(P<0.05)，SHR-12m-F大鼠中IL-6的mRNA的表达高于同性别SHR-6m约69%(P<0.05)，见图1。

2.3SHR肾组织中TNF-α的mRNA表达与SHR-M比较， SHR-6m-F和SHR-12m-F大鼠TNF-α的mRNA的表达明显低于同龄雄性，分别低54%和50%；但年龄因素对的TNF-α mRNA的表达影响不大，见图2。

表2 SHR血中的IL-6和TNF-α的含量

注：与SHR-6m-F大鼠比较，*P<0.05，**P<0.01；与SHR-12m-F大鼠比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与SHR-6m-M大鼠比较，#P<0.05，##P<0.01。

3 讨论

EH已成为世界上最为重要的公共卫生问题，是心血管、脑血管及肾病发病率及死亡率增加的最主要的危险因素。炎症可能参与高血压及高血压相关并发症的病理学过程，在高血压靶器官损失发展过程中起了一定的作用[9-10]。IL-6是一种参与免疫和炎症反应的多功能的促炎细胞因子，活化的单核细胞是血液中IL-6的主要来源。收缩压以及舒张压的升高与血清IL-6 水平密切相关。这说明其在高血压的病理过程中有着直接或者间接的影响[11]。高血压患者血浆TNF-α浓度明显高于正常血压者，且其浓度随病程进展而逐渐升高。TNF-α对血管内皮有直接损伤作用，可通过直接的细胞毒作用，破坏血管内皮细胞结构和功能的完整性，导致内皮功能障碍；促进炎症介质IL-6的分泌，参与血管平滑肌细胞的增殖、分化和调控，从而使血管壁增厚、管腔狭窄、外周阻力增高，促进高血压形成[12-13]。

本研究以SHR大鼠为研究对象，检测了不同性别6月龄和12月龄EH大鼠血清炎症因子的浓度和肾组织中炎症因子的mRNA表达。IL-6血清浓度和肾组织中mRNA表达的结果是一致的。6月龄和12月龄自发性高血压大鼠血清中IL-6的浓度和肾组织中IL-6 mRNA表达均呈现雄性大鼠明显高于雌性大鼠，同一性别的比较结果显示，老年大鼠(12月龄)的血清中IL-6的浓度和肾组织中IL-6 mRNA表达均高于成年大鼠(6月龄)，提示雌激素呈现了一定的抗炎作用，随着年龄的增长，不论雌雄炎症反应均会增强。

血清TNF-α的浓度在成年大鼠EH中无性别差异,但在老年大鼠呈现雄性大鼠的浓度明显高于雌性大鼠。同性别不同年龄大鼠的结果显示，随着年龄的增长，血清TNF-α的浓度明显升高，这种差别在雄性大鼠更明显。肾组织中TNF-α mRNA表达的结果显示，在同龄不同性别的成年和老年EH大鼠中，雄性大鼠的表达水平明显高于雌性大鼠，但在同一性别不同年龄大鼠中该表达无差异。血清TNF-α的结果和肾脏mRNA表达的结果不一致，推测血清的测定有一定误差，拟在以后的研究中使用灵敏度较高的检测方式进行检测及验证。

综上所述，EH的发生发展中炎症反应起了一定的作用，EH性炎症反应存在性别差异性，并随着病程的进展炎症反应加重。

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