miR-21对急性胰腺炎腺泡细胞凋亡的影响及机制

刘 娜 姚艳粉 原 双

(山东省交通医院重症医学科，山东 济南 250031)

急性胰腺炎(AP)根据严重程度分为轻症、中症和重症AP，其中轻症AP较为常见，预后良好，但重症AP病情多变，常伴有局部并发症和脏器功能衰竭，致死率高〔1〕。胰腺腺泡细胞凋亡与AP的发生发展关系十分密切，已成为AP发病机制及治疗的一个研究热点〔2～4〕。MicroRNA(miRNA)在机体生理活动中发挥重要的调控作用，其异常表达与多种疾病的发生发展关系紧密。有研究发现，miR-21在AP患者中存在低表达，且随病情的发展而降低，与AP的发生与发展有密切关系〔5〕，但其对AP腺泡细胞凋亡影响的研究未见报道。本研究通过雨蛙素处理大鼠胰腺腺泡AR42J细胞构建AP环境后，观察miR-21表达，并通过脂质体转染方式下调其表达后，观察其对AR42J细胞凋亡的影响及机制。

1 材料与方法

1.1材料 大鼠胰腺腺泡AR42J 细胞购于美国American Type Culture Collection公司。雨蛙素购于美国sigma公司，胎牛血清、RPMI1640培养基、磷酸盐缓冲液(PBS)和青链霉素购于美国Gibco公司。肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-6酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒购于上海普盛生物公司，淀粉酶(AMY)检测试剂盒购于美国Bio Assay Systems公司，Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒、Trizol试剂、Lipo2000转染试剂购于美国Invitrogen公司。聚偏氟乙烯(PVDF)膜购于美国Millipore公司，β肌动蛋白(β-actin)抗体、第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源基因(PTEN)抗体、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(酶切caspase)-3抗体及辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔二抗购于武汉博士德生物工程有限公司。RNA 提取试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒、反转录试剂盒和电化学发光(ECL)试剂盒购于美国Thermo Fisher公司，miRNA-21 inhibitor 购于上海吉玛基因公司，RIPA细胞裂解液购于上海生工生物工程有限公司，NanoDrop2000和细胞培养箱购于美国Thermo公司，流式细胞仪购于美国BD公司，电泳仪和电转仪购于美国Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养及AP细胞模型构建 将AR42J细胞培养在加有RPMI1640培养基(含有10%的胎牛血清和抗生素)的培养瓶中，置于CO2浓度为5%的37℃恒温培养箱中常规培养。造模前1 d，取6孔细胞板，将培养的AR42J以55 000个/孔进行接种，每孔加入1 ml RPMI1640培养基，置于培养箱中培养过夜。加浓度为15 nmol/L雨蛙素，震荡混匀后，置于孵箱中培养至所需时间点(0、4、8、12和24 h)后收集上清液及AR42J细胞，备用。

1.2.2AMY、TNF-α和IL-6检测 参照ELISA试剂盒说明书的操作步骤检测上述雨蛙素处理后的AR42J细胞上清液中AMY、TNF-α和IL-6的浓度。每组实验均重复3次。

1.2.3RT-qPCR检测miR-21表达 将AR42J细胞转移至1.5 ml的EP管，离心后弃上清。经PBS洗涤后，加入Trizol试剂抽提总RNA，并以NanoDrop2000定量。采用逆转录试剂盒合成cDNA，并以其为模板链20 μl反应体系进行PCR扩增，反应体系：cDNA 1 μl，2×Master Mix 10 μl，F/R引物各0.5 μl，ddH2O 8 μl。扩增条件：预变性95℃ 6 min循环1次，变性95℃ 15 s循环40次，退火60℃ 60 s循环40次。以U6为内参，2-△△CT法进行分析。每组实验均重复3次。

1.2.4转染 在转染前1 d，以6孔板接种550 000个雨蛙素处理过的AR42J细胞，随机分为AP组、AP+NC组和AP+miR-21 inhibitor组。先以无血清培养基分别稀释Lipo2000转染试剂、miR-21 inhibitor和阴性对照miRNA，使miR-21 inhibitor和阴性对照miRNA终浓度为100 nmol/L。再将稀释过的Lipo2000溶液与miR-21 inhibitor混匀加入AP+miR-21 inhibitor组细胞中，Lipo2000溶液与阴性对照miRNA混匀后加入AP+NC组细胞中，而AP组中只加入Lipo2000转染试剂。置于孵箱中培养，待转染6 h后，更换为完全培养基后再继续培养48 h。

1.2.5流式细胞仪分析细胞凋亡 取1.2.1中未经雨蛙素处理的AR42J细胞(设为对照组)和上述转染后培养48 h的AP组、AP+NC组和AP+miR-21 inhibitor组细胞，按照Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒说明书操作步骤检测细胞凋亡率。每组实验均重复3次，取均值。

1.2.6Western印迹检测酶切caspase-3和PTEN蛋白表达 收集AP组、AP+NC组和AP+miR-21 inhibitor组细胞，经PBS洗涤后，离心弃上清。加入RIPA细胞裂解液提取总蛋白，并以BCA法进行定量。将配制好的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)放入盛有适量 1倍蛋白电泳缓冲液的电泳槽内，以每孔50 μg蛋白样本上样，进入分离胶之前采用90 V电压，之后改用120 V电压至电泳结束。采用半干法将蛋白凝胶转至PVDF膜。转膜2 h后，将膜取出，置于含有5% 脱脂牛奶的封闭液中常温下反应2 h。加入1 000倍稀释的一抗(酶切caspase-3抗体和PTEN)4℃下孵育24 h后，置于TBST溶液中以每次15 min洗膜3次，再置于2 000倍稀释的二抗中37℃下反应2 h。经TBST液洗膜后，滴加ECL化学发光液显色，Bio-Rad凝胶电泳成像仪扫描收集图片，并以β-actin校正，Quantity One软件分析目的蛋白的相对表达量。每组实验均重复3次。

1.3统计学分析 运用SPSS22.0软件进行t检验和多组间ANOVA分析。

2 结 果

2.1AP模型检测 与0 h相比，雨蛙素处理4、8、12和24 h后，AMY、TNF-α和IL-6的表达均呈现先升高后下降的趋势，且均在处理8 h时达到最大(P<0.05)。见表1。

表1 雨蛙素处理不同时间AR42J细胞上清液中AMY、TNF-α和IL-6表达

与0 h比较：1)P<0.05

2.2miR-21在AP环境下低表达 与0 h(1.05±0.18)相比，AR42J细胞中miR-21的表达水平在4 h时(0.89±0.12)变化不明显，但在8、12和24 h时(0.35±0.07、0.20±0.02、0.18±0.03)显著降低(P<0.05)，且从1～24 h时间内miR-21的表达水平几乎不变。

2.3miR-21抑制雨蛙素诱导的AR42J细胞凋亡 未经雨蛙素处理的对照组AR42J细胞的凋亡率(8.37%±1.15%)较低，而经雨蛙素处理后的细胞凋亡率明显升高(P<0.05)，与AP组(21.22%±2.76%)相比，AP+NC组(22.08%±3.14%)差异无统计学意义(P>0.05)，而AP+miR-21 inhibitor组(11.53%±1.32%)显著降低(P<0.05)。

2.4miR-21对细胞中酶切caspase-3和PTEN蛋白表达的影响 AP组和AP+NC组中酶切caspase-3和PTEN蛋白表达水平基本相同，而AP+miR-21 inhibitor组酶切caspase-3蛋白表达水平明显低于AP组，PTEN明显高于AP组(P<0.05)。见图1，表2。

图1 Western 印迹检测结果

组别酶切caspase⁃3PTENAP组032±003057±006AP+NC组035±002062±005AP+miR⁃21inhibitor组070±0061)118±0091)

与AP组比较：1)P<0.05

3 讨 论

AP是一种急性病，尽管对其认知和治疗随着医学领域的发展有所提高，但目前仍没有有效的治疗手段。AP的发生机制是一个多阶段和多基因调控的复杂过程，AP的严重程度与胰腺腺泡细胞凋亡呈负相关〔6〕。AR42J细胞是一种来自大鼠胰腺腺泡细胞瘤的细胞，因其具有易培养、刺激反应大和转染效率高等优势，多用于AP细胞模型的构建〔7，8〕。

AP的发生和发展离不开miRNAs的调控〔9〕。miR-21是一种与炎症关系极为密切的miRNAs，在巨噬细胞、T 淋巴细胞、B 淋巴细胞和单核细胞等多种免疫细胞中均有表达〔10〕。miR-21的异常表达除与肿瘤的发生有关外，还有哮喘、心血管疾病和神经退行性疾病等有关〔11～13〕。已有研究证实，miR-21在肺鳞癌、大肠癌和肝癌等细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡过程中发挥重要作用〔14～16〕。Das等〔17〕指出，miR-21在机体受到重大创伤时会下降，恢复后则又增加。Sheedy〔10〕也指出miR-21在炎症的平衡和机体功能恢复过程中发挥关键作用。近年来，有研究发现miR-21在AP中低表达，且与AP的病情发展关系密切〔5〕。本研究提示，AP中miR-21可能通过抑制AP腺泡细胞凋亡加重病情的发展。

caspase-3是公认的caspase-3家族中的执行凋亡蛋白，与AP的发生发展关系密切。黄亨烨等〔18〕研究发现，轻症AP患者中caspase-3高表达，且随着病情进展，Caspase-3表达减弱。PTEN是PI3K信号通路中一个重要的负调控因子，除在肿瘤中发挥抑增殖和促凋亡的抑癌作用外，也与炎症的发生有关〔19〕。吴晓鹏等〔20〕发现，PTEN可能通过介导PI3K/AKT信号通路调控炎性通路TLR4-NF-κB，进而调控巨噬细胞介导的炎症过程。资料显示，PTEN是miR-21下游的靶基因〔21〕，因此推测miR-21可能介导PTEN在调控AR42J细胞凋亡过程中发挥重要作用。本研究进一步提示，在AP中，miR-21可能通过下调酶切caspase-3和上调PTEN蛋白表达抑制AP腺泡细胞凋亡，进而加重病情。

1IAP WG.Guidelines APAAP.IAP/APA evidence-based guidelines for the management of acute pancreatitis〔J〕.Pancreatology,2013;13(4):e1-15.

2Liu Y,Yang L,Chen KL,etal.Knockdown of GRP78 promotes apoptosis in pancreatic acinar cells and attenuates the severity of cerulein and LPS induced pancreatic inflammation〔J〕.PLoS One,2014;9(3):e92389-97.

3Xu P,Lou X L,Chen C,etal.Effects of peroxisome proliferator-activated receptor-γ activation on apoptosis in rats with acute pancreatitis〔J〕.Dig Dis Sci,2013;58(12):3516-23.

4Lin Z,Guo J,Xue P,etal.Chaiqinchengqi decoction regulates necrosis-apoptosis via regulating the release of mitochondrial cytochrome c and caspase-3 in rats with acute necrotizing pancreatitis〔J〕.J Tradi Chin Med,2014;34(2):178-83.

5周慧明,付 萍,杜丹廷,等.血清胃肠激素及循环血microRNA与急性胰腺炎的相关性〔J〕.疑难病杂志,2015;14(5):462-3.

6朱 勇,崔建娇,张明智,等.甘氨酸对重症急性胰腺炎肺组织中髓样细胞触发受体-1mRNA及高迁移率族蛋白-1表达的影响及临床意义〔J〕.中国老年学杂志,2016;36(5):1055-6.

7Cao Y,Yang W,Tyler MA,etal.Noggin attenuates cerulein-induced acute pancreatitis and the impaired autophagy〔J〕.Pancreas,2013;42(2):301-7.

8付兰英,饶春燕,赵晓晏.硫化氢对离体大鼠胰腺腺泡细胞炎症因子表达的影响〔J〕.第三军医大学学报,2013;35(8):784-8.

9贾重阳,张辰龙,张小强.microRNAs在急性胰腺炎中的研究新进展〔J〕.中华卫生应急电子杂志,2017;3(3):180-2.

10Sheedy FJ.Turning 21:induction of miR-21 as a key switch in the inflammatory response〔J〕.Front Immunol,2015;6(19):1-9.

11刘兰英,周 姗,王和生.微RNA在支气管哮喘中与Th2相关促炎因子的研究进展〔J〕.医学综述,2015;21(23):4252-5.

12Quiat D,Olson EN.MicroRNAs in cardiovascular disease:from pathogenesis to prevention and treatment〔J〕.J Clin Invest,2013;123(1):11-8.

13Molasy M,Walczak A,Szaflik J,etal.MicroRNAs in glaucoma and neurodegenerative diseases〔J〕.J Human Gene,2017;62(1):105-12.

14Xu L,Wu Z,Chen Y,etal.MicroRNA-21(miR-21)regulates cellular proliferation invasion migration and apoptosis by targeting PTEN.RECK and Bcl-2 in lung squamous carcinoma.Gejiu City.China〔J〕.PLoS One,2014;9(8):e103698-708.

15Xiong B,Cheng Y,Ma L,etal.MiR-21 regulates biological behavior through the PTEN/PI-3 K/Akt signaling pathway in human colorectal cancer cells〔J〕.Int J Oncol,2013;42(1):219-28.

16Najafi Z,Sharifi M,Javadi G.Degradation of miR-21 induces apoptosis and inhibits cell proliferation in human hepatocellular carcinoma〔J〕.Cancer Gene Ther,2015;22(11):530-5.

17Das A,Ganesh K,Khanna S,etal.Engulfment of apoptotic cells by macrophages:a role of microRNA-21 in the resolution of wound inflammation〔J〕.J Immunol,2014;192(3):1120-9.

18黄亨烨,施 悦,陆丹妮,等.凋亡相关因子Caspase-3、Survivin在急性胰腺炎患者中的表达及意义〔J〕.临床和实验医学杂志,2017;16(17):1665-8.

19苏 强,李 浪.PTEN与炎症关系的研究进展〔J〕.重庆医学,2014;43(4):494-7.

20吴晓鹏,王选琦,李 妍,等.PTEN对ox-LDL诱导的巨噬细胞炎性因子的影响及机制研究〔J〕.心脏杂志,2014;26(6):646-51.

21Zhu HY,Li C,Bai WD,etal.MicroRNA-21 Regulates hTERT via PTEN in Hypertrophic Scar Fibroblasts〔J〕.PLoS One,2014;9(5):e97114-23.