原花青素对脑出血后脑水肿及继发性脑损伤炎症的作用研究

石 磊,赵 焱,徐治强,王建祥,彭 翔

(湖北省武汉市普爱医院神经外科 430033)

脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)指脑实质的非创伤性出血，是一种严重危害人们健康的疾病，常发生于50岁以上患者，占急性脑血管病的20%～30%。我国每年因ICH死亡的人数高达100万，在急性脑血管病中病死率最高[1]。无论保守治疗还是手术治疗，脑血管病病情的恶化均与ICH后脑水肿和继发性脑损伤密切相关[2]。然而，目前尚缺乏有效的预防手段及治疗脑水肿及继发性脑损害的药物。原花青素是一大类多酚化合物的总称，具有强效的抗氧化作用，且具有抗炎、抗糖尿病、保护缺血性脑损伤、保护心血管等药理作用，是极具发展前景的天然植物提取物[3]。本研究探讨原花青素对ICH后脑水肿及继发性脑损伤的影响及其机制，进一步明确原花青素的药理作用及应用前景，为预防及治疗ICH后继发性脑损伤提供一定的实验及理论依据。

1 材料与方法

1.1材料 实验动物：健康C57BL6雄性小鼠48只，体质量(250±30)g，由湖北省实验动物中心提供，动物饲养室为屏蔽环境，控制室温约为22 ℃，室内湿度约为55%。动物实验过程符合实验动物伦理学要求。试剂：原花青素(含量大于95%，Solarbio公司，中国)，胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗体及小胶质细胞/巨噬细胞特异性蛋白抗体(ionized calcium binding adapter molecule 1,Iba-1)抗体(Abcam公司，英国)，正置显微镜(Olympus公司，日本)。

1.2方法

1.2.1动物模型分组及给药 根据前期实验摸索，原花青素浓度使用中浓度(100 mg/kg)比较合适。8月龄健康C57BL6雄性小鼠分为4组，Sham+生理盐水组、Sham+原花青素(100 mg/kg)组、ICH+生理盐水组、ICH+原花青素(100 mg/kg)组。4组小鼠分别灌胃给药7 d后取材。

1.2.2ICH模型制备 C57BL6小鼠用3%水合氯醛腹腔注射麻醉后，暴露前囟，将小鼠放置于立体定位仪上，在前囟后0.2 mm，中线右3.0 mm处钻孔，微量加样器沿颅骨孔垂直进针6.0 mm，缓慢注入自体尾动脉血20 μL，对照组注入等量的生理盐水。手术结束后记录时间，各组小鼠正常饮食，分笼饲养。

1.2.3神经功能评分 观察术后各组小鼠，Bederson法对神经功能进行初步评估[4]。Bederson法：轻抓尾巴，提起高于桌面10 cm，正常小鼠前爪伸直。0分：无神经功能缺损；1分：脑部病变对侧腕关节、肘关节屈曲，肩内收屈曲；2分：上述体征+向麻痹侧推阻力下降；3分：活动是向麻痹侧打圈(追尾状)。以造模后4、8、12、24 h为时间点，对各组小鼠进行神经功能评分。

1.2.4干湿比重法测定脑组织含水量 造模后24 h处死小鼠，在冰盘上断头取脑，用冰生理盐水冲洗3次，洗去积血。迅速切取进针孔前半部分脑组织，精确称重(0.1 mg)。然后将称好的脑组织置于恒温烘干箱中烘干，准确称取干重。根据Elliott公式计算脑组织含水量：脑含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.2.5苏木素-伊红(HE)染色 造模后24 h向小鼠腹腔注射4%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，迅速开腔，从右心耳先后灌注0.9%生理盐水约150 mL，4%多聚甲醛约300 mL。待彻底灌注完成后，断头取脑，切取部分脑组织，进行组织包埋、切片及HE染色，显微镜下观察出血区及周围的神经细胞的形态改变。

1.2.6Western blot检测 取各组小鼠脑海马区组织，将其剪成细小碎片，按250 μL/20 mg将含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解液加入碎片组织，使用匀浆器将其匀浆至完全裂解。然后将完全裂解的组织样本置入4 ℃下12 000 r/min离心15 min，取上清液进行蛋白定量后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)跑胶，然后转膜，利用一抗GFAP抗体(1∶200)、Iba-1抗体(1∶1 000)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)抗体(1:500)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)抗体(1∶500)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)抗体(1∶500)室温孵育1 h后，磷酸盐缓冲液吐温20(phosphate buffered solution Tween-20,PBST)洗涤，用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的二抗(1∶200)室温孵育1 h，PBST洗涤3次。取适量电化学发光(ECL)发光液膜正面进行显色处理后在化学发光分析仪中检测。

1.2.7TUNEL染色 石蜡包埋的组织切片经脱蜡水化后，滴加蛋白酶K室温孵育20 min后，加入50 μL TUNEL反应混合液，湿盒暗室中37 ℃孵育1 h，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，再加入50 μL转化-POK，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3次，滴加50 μL二氨基联。

2 结 果

2.1原花青素对ICH小鼠神经功能的作用 术后Sham各组小鼠出现轻微不适，但没有明显神经功能缺损症状。ICH各组小鼠神经功能缺损症状比较严重，主要表现为前肢肘关节屈曲、不停地转圈、偏瘫，神经行为学评分比较有差异。在4 h时间点，ICH+原花青素组小鼠的神经行为学评分有所降低，但与Sham+原花青素组小鼠相比差异无统计学意义(P>0.05)；12 h后，与ICH+生理盐水鼠相比，ICH+原花青素组小鼠神经功能评分明显降低(P<0.05)，见表1。

2.2原花青素对ICH小鼠脑组织含水量的影响 与Sham+生理盐水组[(75.65±0.74)%]比较，ICH+生理盐水组小鼠[(83.16±1.09)%]脑含水量明显升高(P<0.05)。而原花青素给药治疗后，与ICH+生理盐水组比较，ICH+原花青素组小鼠[(80.38±0.98)%]脑组织含水量有明显降低，比较差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 ICH小鼠不同时间点神经功能评分

2.3原花青素对ICH小鼠脑组织细胞形态的改变 Sham+生理盐水组的小鼠脑组织结构相较正常，形态正常，细胞着色均匀，排列整齐，没有明显出血症状。ICH+生理盐水组小鼠神经细胞肿胀变形，出现自溶空泡现象，并且有大量红细胞血块聚集，血块周围组织松散，细胞核固缩。原花青素给药后，ICH+原花青素组小鼠神经细胞变形发生空泡数量减少，红细胞聚集明显降低，组织结构趋近紧密，细胞核固缩现象减少,见图1。

2.4原花青素对ICH小鼠脑组织细胞凋亡的作用 Sham+生理盐水组和Sham+原花青素组小鼠海马区脑组织偶见凋亡细胞，ICH+生理盐水组小鼠海马区脑组织见大量凋亡细胞表达，多见于高密度细胞层，染色质浓缩，核固缩。与ICH+生理盐水组小鼠比较，ICH+原花青素组小鼠海马区脑组织细胞凋亡密集度较低，核内染色质浓缩程度偏低，染色阳性的棕黄色颜色相对较浅，细胞凋亡数较少，见图2。

2.5Western blot检测 ICH发生后，小鼠脑细胞Bcl-2表达下调，Bax和Caspase-3表达上调，脑组织细胞发生明显凋亡。原花青素给药后，ICH小鼠脑细胞Bcl-2表达上调，Bax和Caspase-3表达下调；ICH小鼠脑组织GFAP和Iba-1表达上调，而原花青素给药治疗后，ICH小鼠脑组织GFAP和Iba-1表达下调，见图3。

A：Sham+生理盐水组；B：Sham+原花青素组；C：ICH+生理盐水组；D：ICH+原花青素组

A：Sham+生理盐水组；B：Sham+原花青素组；C：ICH+生理盐水组；D：ICH+原花青素组

A：Western blot凝胶图；B：细胞凋亡因子的表达水平；C：细胞GFAP和Iba-1的表达水平

3 讨 论

小胶质细胞是中枢神经系统的免疫细胞，激活的小胶质细胞针对受损的细胞发挥免疫调节、修复等作用[5]，但小胶质细胞过度激活后会对细胞产生毒性影响[6]。Iba1是小胶质细胞标志物。研究发现，ICH发生后血肿周围的细胞破坏裂解后释放大量的三磷酸腺苷(ATP)，诱导小胶质细胞分泌多种细胞因子，促进炎性反应的发生[7]。小胶质细胞在ICH后异常活跃，并且可以检测到小胶质细胞分泌的促炎症因子，对血灶周围的正常细胞产生神经毒性及炎性反应，诱导脑细胞的凋亡坏死[8]。本研究结果发生ICH后，脑组织小胶质细胞标志物Iba1表达明显升高，与之前研究结果一致。

星形胶质细胞(astrocyte,Ast)是中枢神经内数量最多的神经胶质细胞，是中枢神经系统重要细胞。有研究发现星形胶质细胞是脑缺血时的主要受累细胞[9]。在受到创伤及脑损伤后星形胶质细胞活化适应损伤，表现为细胞数量增加，突起长度变化[10]。胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)，是星形胶质细胞标志物，主要分布在活化的星形胶质细胞中[11]。活化的Ast产生大量的NO，导致神经细胞的凋亡坏死，介导细胞的炎性反应[12]。因此星形胶质细胞对ICH引发的脑水肿和继发性脑损伤具有重要研究意义。这与本研究结果ICH发生后星形胶质细胞标志物GFAP表达明显升高一致。

原花青素来自于传统中药-莲、松树皮等，是一种强效的抗氧化剂，是极具发展前景的天然植物提取物。近来有研究表明，原花青素有较强的清除自由基，抗肿瘤，预防动脉粥样硬化、降脂、降压，以及改善人体微循环等多重功效[13-16]。原花青素可以通过减轻脑水肿、抗炎、抗氧化及抑制缺血脑组织ASIC1a的表达，有效减轻大鼠脑缺血/再灌注损伤[17]。与本研究结果原花青素可以缓解脑出血后神经功能损伤，降低脑出血后脑组织含水量和脑组织出血量，通过促进Bcl-2表达，抑制Bax和Caspase-3表达进而抑制脑组织神经细胞凋亡一致。

综上，原花青素能缓解ICH后脑组织水肿症状，对ICH小鼠的脑损伤有一定的保护作用，其机制可能是因为原花青素能够通过降低GFAP和Iba-1的表达，减少胶质细胞的活化数量，抑制神经毒性物质的产生，减轻脑水肿及细胞凋亡进而缓解继发性脑损伤。

[1]XI G,HUA Y,KEEP R F,et al.Systemic complement depletion diminishes perihematomal brain edema in rats[J].Stroke,2001,32(1):162-167.

[2]程娟，柯开富．脑出血后继发性脑损伤机制[J]．国际脑血管病杂志，2010，18(10)：787-791．

[3]高羽，董志．原花青素的药理学研究现状[J]．中国中药杂志，2009，34(6)：651-655．

[4]BEDERSON J B,PITTS L H,TSUJI M,et al.Rat middle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and development of a neurologic examination[J].Stroke,1986,17(3):472-476.

[5]TAYLOR R A,SANSING L H.Microglial responses after ischemic stroke and intracerebral hemorrhage[J].Clin Dev Immunol,2013:746068.

[6]梁瑞，吴鹤，戚基萍．活化的小胶质细胞在脑出血后的作用[J]．现代医学，2015，43(2)：262-265．

[7]INOUE K.Microglial activation by purines and pyrimidines[J].Glia,2002,40(2):156-163.

[8]王新，李明军，张坤，等．脑出血与小胶质细胞介导的炎症相关性[J]．中国老年学杂志，2013，33(13)：3268-3270．

[9]PANICKAR K S,NORENBERG M D.Astrocytes in cerebral ischemic injury:morphological and general considerations[J].Glia,2005,50(4):287-298.

[10]BARKER A J,ULLIAN E M.Astrocytes and synaptic plasticity[J].Neuroscientist,2010,16(1):40-50.

[11]LOVE S,MCLEAN C.Overview and recent advances in neuropathology[J].Pathology,2011,43(2):87.

[12]NORDEN D M,FENN A M,DUGAN A,et al.TGFβ produced by IL-10 redirected astrocytes attenuates microglial activation[J].Glia,2014,62(6):881-895.

[13]凌智群，谢笔钧．莲房原花青素对氧自由基和脂质过氧化的作用[J]．营养学报，2002，24(2)：121-125．

[14]何佳声，黄学锋．原花青素对人结肠癌细胞SW620增殖和凋亡的影响[J]．中国中西医结合外科杂志，2010，16(4)：439-442．

[15]马亚兵，高海青，伊永亮，等．葡萄籽原花青素降低动脉粥样硬化兔血清C反应蛋白水平[J]．中国动脉硬化杂志，2004，12(5)：549-552．

[16]薛燕潍，王峰．葡萄籽原花青素预防大鼠动脉粥样硬化作用机制研究[J]．中国实用医药，2010，5(13)：44-45．

[17]陆景红，任明山，李光武，等．葡萄籽原花青素对脑缺血再灌注损伤的保护作用[J]．中国临床康复，2005，9(45)：99-101．