洋葱CMS-T型育性分子标记的筛选与鉴定

潘美红，杨海峰，惠林冲，薛 萍，张新圣，缪美华，陈振泰

(连云港市农业科学院，江苏连云港 222000)

洋葱(AlliumcepaL.)属单子叶天门冬目(Asparagale)百合科(Liliaceae)葱属(Allium)的重要园艺作物[1]，已有4 000多年的栽培历史，被世界各地广泛栽培[2]。联合国粮食与农业组织2012调查数据显示：中国是生产洋葱最多的国家，达到2.05×107t[3]，主要用于外贸出口和国内消费。目前国内洋葱杂交种主要以进口日本和韩国为主，缺乏自主杂交品种。

洋葱是2 a生植物，在杂交育种中，1个世代需跨越3个年份，异花授粉，伞状花序，花小，结籽率低，人工去雄困难，所以利用洋葱细胞质雄性不育(CMS，cytoplasmic male sterility)系选育杂交种尤为重要。首次报道在洋葱品种‘Italian Red’[4]和‘Jaune paille des Vertus’[5]中分别发现CMS-S和CMS-T 2种细胞质雄性不育类型。利用现代DNA分子标记技术，PCR扩增能够快速鉴定洋葱雄性细胞质不育类型；Sato[6]利用cob标记能够区分CMS-S型，而不能区分正常可育株(N)和CMS-T；Engelke等[7]利用 orfA501标记在洋葱不育株中扩增出473 bp条带，可育株没有或很弱，与cob标记相结合区分洋葱可育株N、CMS-S和CMS-T，陈沁滨等[8]和吴海涛等[9]利用此标记将洋葱材料101A鉴定为CMS-S和将8A鉴定为CMS-T。Havey[10]在洋葱叶绿体DNA中开发出Cp-cytotype标记，Kim等[11]利用线粒体DNA中的cob-type2和 atp6标记都能将CMS-S型鉴定，但不能区分正常可育株N和CMS-T，而Kim等[12]利用洋葱线粒体DNA中相关细胞色素c氧化酶亚基I(coxI，cytochromecoxidase subunit I)基因，该基因连接到洋葱 orfA501同系物序列上，与韭菜 orfA501序列相比，其含有 atp9基因的5’序列，由coxI和 orfA501同源物组成2 175 bp连续开放阅读框的嵌合序列，并开发出新的标记命名为 orf725，能够将洋葱3种类型完全区分开。洋葱的细胞质雄性不育表现为母系遗传，主要是由线粒体和叶绿体基因中片段差异造成的[13-14]。目前，针对洋葱的N、CMS-S和CMS-T 3种类型叶绿体DNA基因组已公布，研究表明，可育株N(GenBank数据中登录号：KM088013，下同)和CMS-S(KM088014)核苷酸之间有352个SNPs和141处片段插入或缺失，多态性丰富，而N和CMS-T(KM088015)核苷酸之间有4个SNPs和2处片段插入，根据petN和psbM基因之间的差异，设计Cpp1分子标记，能够利用简单的PCR将洋葱的N、CMS-S和CMS-T 3种类型完全区分开[15]。随后Kim等[16]发表洋葱CMS-S线粒体DNA基因组，序列全长316 363 bp，GenBank数据中登录号：KU318712。洋葱叶绿体和线粒体DNA基因组的公开发表，将更有利于洋葱细胞质雄性不育机制的研究。

国外已经利用恢复基因型(MsMs)、保持系(msms)和不育系(msms)生产洋葱F1杂交种。洋葱不育株可以通过有无花粉判断，而保持系则需要不断地杂交、回交来选择，其随机性大、选育周期长。近年来，RAPD[17]、RFLP[18]、AFLP等[19]分子标记研究洋葱细胞质雄性不育和可育材料的多态性，并开发鉴定洋葱育性遗传位点的分子标记。Jones等[4]研究认为CMS-S不育由1对隐性细胞核基因(msms)控制，而Schweisguth[20]认为CMS-T可能是3个独立的细胞核基因共同控制，杂交后代分离比较复杂，Kim[21]认为洋葱2种不育类型都是由单核基因Ms位点控制，开发出jnurf13分子标记，适合CMS-S和CMS-T 2种类型，并且与Ms位点紧密连锁。所以，通过开发分子标记鉴定纯合的恢复基因型(MsMs)、保持系(msms)和不育系(msms)的基因型对杂交制种尤为重要，能够显著缩短育种年限和减少工作量。目前，国内洋葱杂交种生产相关报道很少，尤其是中日照洋葱品种。本试验拟用cob(s)、cob(n)、 orfA501、Cpp1、 orf725 、jnurf13、AcSKP1、DNF-566、RNS-357、OPT和PsaO共11个与洋葱育性相关的分子标记，对连云港市农业科学院蔬菜课题组(以下简称本课题组)选育的洋葱不育系材料进行验证，筛选出简单、高效的分子标记，为洋葱育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

洋葱试验材料的生态类型为中日照，全部来自于连云港市农业科学院蔬菜研究室，共34份，分别编号为1～34号，供试材料名称和特点见表1，D9和d9、A1和a1、A3和a3、A-2和a-2、A-3和a-3、T和t分别为相配套的不育系和保持系，6套不育系材料引种名称、来源、单位和时间见表2，其中D9和d9、A1和a1为2套稳定的不育系。表1中13号材料是母本黄皮不育株A-2与父本红皮保持株t杂交的粉皮F1(A-2×t)，14号是母本粉皮不育株13号与父本红皮保持系t进行回交的红皮BC1[(A-2×t)×t]。红皮洋葱材料406中筛选出4株不育株，并与406材料中可育株t2、t5、t6、t11分别进行杂交获得F1，分别命名为T-2-2、T-1-5、T-2-6和T-7-11；同时对可育株t2、t5、t6、t11进行自交获得F1，即表1中t-2、t-5、t-6和t-11；512、728、562、B1、H1、911、930、932和948为常规资源材料；T8×512、T10×728、T2×562 3份 材料为杂交种F1。

1.2 试验方法

试验材料在连云港市农业科学院蔬菜试验基地种植，1～14号材料在开花期分别取其1～2片嫩叶，并调查统计是否有花粉，套袋自交，15～34号为随机选取的洋葱鳞茎球，取5～10 g鳞茎片，液氮保存，用北京天根DNA试剂盒(型号：DP350-03)提取洋葱基因组DNA，引物由苏州金唯智生物有限公司合成(表3)，PCR扩增试剂购置于TAKARA公司，反应体系为25 μL，包括：2 μL DNA(0.1 μg)，2.5 μL 10× PCR buffer，1.25 μL(10 μmol/L)正向引物，1.25 μL(10 μmol/L)反向引物，2 μL dNTPs(10 mmol/L)，0.25 μLTaq酶和15.8 mL ddH2O。PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min[22]，AcSKP1采用MK886、MK898、MK620、和MK628四对引物混合PCR 扩增，反应条件参考Huo等[23]，jnurf13的PCR反应条件参考Kim[21]的方法。cob(s)、cob(n)、 orfA501、 orf725、DNF-566和RNS-357的PCR产物采用质量浓度为10 g/L的琼脂糖凝胶进行检测，Cpp1、jnurf13、AcSKP1、OPT和PsaO的PCR产物采用8%的聚丙烯酰氨凝胶(464 mL/L H2O，250 mL/L 1 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8)，266 mL/L 30% Acrylamide，10 mL/L 10% SDS，10 mL/L 10%(NH4)2S2O8，0.6 mL/L TEMED)电泳检测，电压100 V，电泳3 h，硝酸银染色，采用佳能EOS6D相机在胶片灯上拍照记录。

表1 供试洋葱材料编号、株系及特点Table 1 Code,lines and characteristics of tested onion materials

表2 洋葱6份不育材料来源及关系Table 2 Sources and relationship of six onion materials

表3 洋葱分子标记引物Table 3 Primer sequences of molecular markers in onion

2 结果与分析

2.1 洋葱细胞质雄性不育类型鉴定

2.1.1 洋葱不育株表型观察 当洋葱伞状花序上的花朵开裂达到40%～ 60%时，观察结果显示，正常可育株花朵中雄蕊饱满，花药和花粉囊开裂后能够正常弹出花粉(图1-A)，且套袋自交后能够正常结籽。洋葱的不育株花朵开裂后，雄蕊较弱，花药在发育过程中渐渐萎缩干枯，无花粉粒弹出，套袋自交不结籽(图1-B)。对洋葱材料1～14 号进行表型观察和套袋后，1～6号洋葱花药有花粉弹出，套袋自交结籽，说明是可育株；7～14 号洋葱花药无花粉弹出，套袋自交未结籽，说明是不育株。

图1 洋葱可育株(A)和不育株(B)花序形态特性Fig.1 Morphological characteristics of fertile flowers (A) and sterile flowers (B)

2.1.2 洋葱不育类型鉴定 采用cob标记对1～14 号洋葱材料进行PCR扩增，cob(s)标记结果显示在414 bp大小处没有条带或很弱，初步说明1～14号都不是S型不育(图2-A)，而cob(n)标记结果显示只在180 bp大小处条带很亮，说明1～14 号是可育或T型细胞质不育；用 orfA501标记引物只能在不育系中扩增出473 bp大小的条带,而可育系中没有或者很弱，结果显示1～6号没有条带或很弱，而7～14号扩增出473 bp，条带清晰，结果与Sato等[6]和Engelke等[7]报道一致，以上分子标记结果表明：洋葱材料1～6 号是可育株，7～14号为CMS-T不育株。 orf725[12]能够在可育株中扩增出1条833 bp的条带，T型中扩增出833 bp和628 bp 2条带，而在S型中只能扩增出1条628 bp的条带，结果显示本试验材料1～6号PCR扩增出1条带，说明是可育株，7～ 14号扩增出2条带，为CMS-T型不育株。Cpp1[15]标记是根据洋葱叶绿体基因组DNA核苷酸序列的差异开发出的标记，能够在可育株中扩增出1条264 bp的条带，T型中扩增出1条307 bp的条带，而在S型中扩增出1条254 bp的条带，由于3条带大小差异只有10～53 bp，PCR产物采用聚丙烯酰氨凝胶电泳(PAGE)检测，从图2-E中看出1条307 bp很亮的条带和1条264 bp亮度较弱的条带，不能有效区分本试验材料的不育类型。

株系1 Breeding lines 1.d9；2.a3；3.a-3；4.a1；5.t；6.a-2；7.D9；8.A3；9.A-3；10.A1；11.T；12.A-2；13.A-2×t；14.(A-2×t)×t；A.cob(s)；B.cob(n)；C. orfA501；D. orf725；E.Cpp1

图2不同引物对洋葱不育类型鉴定
Fig.2Identificationofonionsteriletypewithdifferentprimers

2.2 洋葱育性恢复基因型(Ms)验证

本课题组早期通过传统的杂交、回交在洋葱同一品种中筛选出稳定的保持系和不育系d9和D9、a1和A1，选用前人报道的DNF-566、RNS-357、jnurf13、PsaO、OPT和SKP1[23](MK886、MK898、MK620、MK628)共6个分子标记对1～34号材料进行验证，DNF-566标记能够在含有Ms位点中扩增出556 bp，RNS-357标记只在含有ms位点的洋葱中扩增出1条357 bp的条带，而含有Msms中能同时扩增出2条带。结果表明1～4、6～19、23、28、29、31和33号材料显示只有1条357 bp的条带，说明该材料基因型为msms；21、24和26号扩增出1条566 bp的条带，基因型为MsMs；22、25、30、32和34号扩增出2条带，其中25和32号2条带较弱，基因型为Msms；而5、20和27 3个材料2个标记均无条带(图3-A和图3-B)。

OPT标记能够在含有Ms位点中扩增出1条659 bp的条带，在含有ms位点中扩增出1条357 bp的条带，而含有Msms中能同时扩增出2条带，同样PsaO能够在含有Ms位点中扩增出1条490 bp的条带，在含有ms位点中扩增出1条437 bp的条带，而含有Msms中能扩增出2条带。结果显示OPT分子标记鉴定结果与PsaO分子标记互相矛盾，如11、14、22和24号，OPT标记鉴定为MsMs，而PsaO鉴定为Msms；16、27、30、31和34号，OPT标记鉴定为Msms，而PsaO鉴定为MsMs；2个分子标记鉴定结果相同的为5、15、20、28、29和33号，基因型为MsMs，23和25号为Msms，其他均不同(图3-C和图3-D)，所以，OPT和PsaO标记不适合作为本试验材料的筛选Ms遗传位点。

为了能够准确鉴定洋葱可育株N、CMS-S和CMS-T 3种类型，Kim[21]报道的jnurf13分子标记可以用于区分3种类型，能够在含有Ms位点中扩增出1条241 bp的条带，在含有ms位点中扩增出1条229 bp的条带，而含有Msms中能扩增出2条带。Huo等[23]开发出的SKP1标记能够区分洋葱可育株N和CMS-S 2种类型，能够在含有Ms位点中扩增出1条898 bp的条带，在含有ms位点中扩增出1条628 bp的条带，而含有Msms中能扩增出2条带，但未对T型细胞质雄性不育类型进行报道。本试验材料中包括CMS-T类型，结果发现jnurf13和SKP1标记的结果完全一致，2个标记显示7～14号基因型为msms，且为不育株，与表型观察的结果相符合，20、21、24、26和27号5个材料基因型为MsMs，5、22、23、25、30、33和34号7个材料基因型为Msms，其他22个材料基因型为msms。对6个标记结果分析表明，DNF-566、RNS-357、jnurf13和SKP1中7～14号符合Ms遗传规律(表4)，基因型为纯合msms不育株，初步分析表明：jnurf13和SKP1标记适合本材料筛选Ms遗传位点。

不同洋葱材料1 Different onion materials 1.d9；2.a3；3.a-3；4.a1；5.t；6.a-2；7.D9；8.A3；9.A-3；10.A1；11.T；12.A-2；13.A-2×t；14.(A-2×t)×t；15.t-11；16.t-2；17.t-5；18.t-6；19.512；20.728；21.562；22.B1；23.H1；24.911；25.930；26.932；27.948；28.T-7-11；29.T-2-2；30.T-1-5；31.T-2-6；32.T8×512；33.T10×728；34.T2×562。A.DNF-566；B.RNS-357；C.OPT；D.PsaO；E.jnurf13；F.SPK1

图3 洋葱Ms位点分子标记PCR验证Fig.3 Identification of simple PCR markers linked to the Ms locus in onion

注：A.显性纯合子(MsMs)；H.杂合子(Msms)；B.隐性纯合子(msms)；D.显隐性纯合子或杂合子(MsMs，Msms，msms)。

Note:A.homozygous dominant (MsMs)； H.heterozygous (Msms)； B.homozygous recessive (msms)；D.homozygous dominant,homozygous recessive,or heterozygous(MsMs,Msms,msms).

2.3 洋葱不同标记实用性比较

综合比较洋葱不育系鉴定相关分子标记cob(s)、cob(n)、 orfA501、 orf725和Cpp1，其中 orf725能够简单、快速的鉴定洋葱N、CMS-S和CMS-T 3种类型。与洋葱育性相关的6个分子标记jnurf13、AcSKP1、DNF-566、RNS-357、OPT和PsaO中(表5)，其中jnurf13和AcSKP1能够准确鉴定本试验材料，包括CMS-T类型，AcSKP1采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，用时少、速度快，但其采用混合PCR扩增比jnurf13普通PCR扩增所用试剂成本高，jnurf13标记试剂成本较低，比较适合生产应用。

表5 洋葱不同标记实用性比较分析Table 5 Comparison and analysis of different marks of onion

3 讨 论

洋葱细胞质雄性不育系是解决洋葱杂交制种最有效的途径之一，在生产实践中，通过田间观察，易发现不育株，进一步通过分子标记来验证不育类型。自Jones等[4]和Berninger等[5]报道洋葱CMS-S和CMS-T，很多分子标记被用来区分不育类型，Cp-cytotype[25]、cob[6]、atp6和cob-type2[11]都只能区分CMS-S型，且有的PCR扩增后还需要进行后续酶切反应。orf501[7]只能区分不育和可育株，需要和上述鉴定S型的标记联合分析，才能将洋葱N、CMS-S和CMS-T区分开(图2-A、图2-B、图2-C)， orf725[12]和Cpp1[15]可以用简单的PCR区分洋葱3种类型，本试验材料中用 orf725分子标记能够区分N和CMS-T类型，与cob和orf501结果一致，而Kim等[15]利用叶绿体基因组DNA开发的Cpp1标记能够区分3种类型，Cpp1标记分析130份来源于不同国家地区的栽培种，发现83份N型中含有54 bp的插入，与CMS-T完全一致，但无法区分N和CMS-T 2种类型。本试验中1～14号为N与CMS-T类型，PCR扩增条带大小完全一致，不能有效地进行区分，与Kim报道结果一致，其同时提出新的模型，即正常可育株N分为N-Type1，含有43 bp插入的为N-Type2，CMS-T分为CMS-T-Type1，含有1 bp 的SNP的插入类型为CMS-T-Type2。本试验中的1～6号按此分类对应是N-Type2，其他还需要进一步测序分析。虽然洋葱CMS-S型线粒体基因组DNA已发布，但还需要进一步研究分析SNP三者之间的差异。比较上述分子标记在随机材料中验证不育株的类型，结果表明 orf725分子标记最为简单、经济实用。

控制洋葱育性相关的基因研究，最早由Jones等[4]提出CMS-S由Ms基因控制，Schweisguth等[20]认为CMS-T由3个独立的细胞核基因共同控制，随着分子标记的广泛应用，ACms.1100[17]、jnurf05和jnurf17[26]、jnurf12和jnurf13[21]、OPT和PsaO[27]、WHR240[28]、PMS1[29]、DNF-566和RNS-357[19]、Ms[30]等与Ms位点相关标记被开发应用，12个分子标记中，只有jnurf12和jnurf13标记报道3种类型(N、CMS-S和CMS-T)，其他10个标记只报道N、CMS-S 2种材料，其中ACms.1100和PMS1标记都以‘506L’为CMS材料，并未指出S或T型，而本试验不育材料都为CMS-T型。ACms.1100标记位于jnurf17和jnurf06标记之间， jnurf12标记没有与任何重组体的Ms基因座完美连接，比位于0.05 cM距离的jnurf05标记更接近于Ms基因座，然而，当用jnurf12标记分析不同来源的CMS-S时，标记基因型出现差异。jnurf13是位于jnurf12标记侧翼的约5.5 kb序列，依据有12 bp的插入，开发设计出jnurf13分子标记适合洋葱3种不同类型的鉴定[21]。jnurf13分子标记验证1～34号材料，7～14号为不育系，33和34号为杂交种，验证结果与表型完全一致，所以，本试验结果支持Kim提出的洋葱3种类型(N、CMS-S和CMS-T)是由Ms位点控制，同时，AcSKP1分子标记验证结果与jnurf13标记完全一致，首次报道AcSKP1标记适合本试验提供的细胞质雄性不育T型。DNF-566和RNS-357标记只能分别鉴定Ms和ms，2个标记结合分析，5、20和27号经重复PCR扩增试验后无条带(图3-A、图3-B)，排除人为操作或试剂仪器等问题，其他31份材料中，只有23、32和33号3个材料结果与jnurf13、SKP1不一致，其他完全一致，尤其是7～14号CMS-T材料，3个标记结果完全一致，更进一步支持Kim的观点。而Huo等[27]报道的PsaO和OPT标记，基于‘506L’和‘H6’ 2个品种的F1和F2，而对于田间随机的CMS-S材料就不能完全适应，发现2个标记与其他3个标记结果有很多不同之处，所以，PsaO和OPT标记不适合作为本试验材料的Ms育性相关标记的验证。

另外，在洋葱中报道的标记ACms.1100，不能确定是连锁标记或功能标记[17]；WHR240标记基于洋葱花蕾期cDNA序列，操作繁琐[28]；Ms标记能够在田间直接应用筛选S型不育系和保持系[31]，但CMS-T是否适合并未报道。而最新研究报道基于洋葱材料混合群体分离分析法(BSA)和转录组测序(RNA-seq)得到30个与Ms遗传位点相关候选基因，其中14个连锁不平衡，并对其cDNA全长测序，在可育株和不育株间进行氨基酸比对，发现有4个基因的氨基酸有差异，其中的 PMS1基因组DNA中有错配修复，是最好的候选基因标记，并对其进行相关验证[29]，但是否适合本试验材料还需进一步验证。尽管jnurf13和AcSKP1标记适合本试验材料，但是从生产应用选育恢复基因型(MsMs)、保持系(msms)和不育系(msms)角度考量，AcSKP1分子标记采用的是混合PCR，试剂耗材成本相对高，而jnurf13分子标记适用于简单PCR验证，所以，jnurf13分子标记更适合在洋葱大田生产中应用。

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