中药抗大肠杆菌O157:H7的筛选及其在体外瘤胃发酵中的应用

王东升,田晓娟,张国华,黄江丽,何 力,计少石,圣 平,张志红,丁建南

(江西省科学院生物资源研究所,江西 南昌 330096)

大肠杆菌O157:H7是一种具有严重危害的食源性肠道致病菌,可以引起人出血性结肠炎、溶血性尿毒综合征等疾病,所以又称肠出血性大肠杆菌。该菌在加拿大、美国感染流行最多,其感染具有强烈的致病性、致死性以及抗生素治疗可能会加剧病情等特点,目前已成为全球性的公共卫生问题。近些年来,在国内肉制品中屡屡检出E.coliO157:H7,江苏省徐州市2006-2009年对熟肉制品、生肉、蔬菜沙拉等产品进行检测,E.coliO157:H7的检出率为1.21%[1],且主要集中在生肉和蔬菜沙拉上,说明食用生肉仍是其感染的主要途径。因此,控制动物感染E.coliO157:H7,是有效防控和解除该菌对人们健康威胁的关键。

由于抗生素的广泛滥用,导致出现了大量的耐药菌株,给人类、动物及环境带来了巨大的危害,在欧盟已经禁止抗生素作为饲料添加剂来使用,我国也逐渐禁止。因此,研究和开发利用中药控制E.coli O157:H7对解决抗生素禁用问题是一个重要的途径。本研究从泽漆、黄芪、黄连等11种中药的水提液和醇提液中筛选对E.coli O157:H7有抑菌作用的,然后抑菌作用强的几种提取液做体外瘤胃发酵抑菌试验,以便为这几种中药提取液作为反刍动物饲料添加剂的应用及发展提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 泽漆、黄芪、黄连、虎杖、肉桂、丁香、厚扑、黄芩、石斛、白芍、夏枯草;Escherichia coli O157:H7(菌株编号:CICC21530);体外瘤胃发酵底物:稻草粉、玉米粉和黄豆粉按照2∶1∶0.3的比例配制。

1.2 中药提取液制备 将中药打粉过40目筛后分别用水提法、醇提法进行提取。

1.2.1 水提法 取中药粉100 g,加入1 000 mL蒸馏水,在60℃的水浴中放置10 h(期间多次摇动),10 000 r/min离心10 min,取上清,上清经60℃旋转蒸发浓缩至100 mL(相当生药量1 g/mL),冰箱保存备用。

1.2.2 醇提法 取中药粉100 g,加入1 000 mL无水乙醇,操作方法与水提法相同。

1.3 中药提取液抑菌试验 E.coli O157:H7在LB培养基中培养至浓度106CFU/mL,取150 μL菌液涂布于LB固体培养基,放上灭菌牛津杯,加入100 μL中药提取液(处理组)、灭菌水(无水乙醇,阴性对照)或青霉素(阳性对照),过夜培养,观察并测量抑菌圈大小。

1.4 体外瘤胃发酵试验 试验设对照组和处理组,每组4个重复,每个重复加入100 μL浓度为106CFU/mL的E.coli O157:H7,中药提取液添加量均为500 μL。牛瘤胃液从装有永久性瘤胃瘘管的瘤胃中采集,采用本研究室改进的体外瘤胃模拟装置培养24 h后,取培养物备用[2]。

1.5 体外瘤胃发酵物总DNA提取 体外瘤胃培养物12 000 r/min(4℃)离心10 min,弃上清,沉淀用OMEGA粪便DNA提取试剂盒提取微生物总DNA,经1%琼脂糖凝胶电泳,检测 OD260/OD280比值。

1.6 相对定量PCR 以提取的总DNA为模板,采用RT-PCR方法测定体外瘤胃发酵过程中中药提取液对 E.coli O157:H7的抑制效果,以细菌16S rDNA为参照基因,引物参照Denman等[3],选择E.coli O157:H7的特异性基因rfbE为检测靶基因,引物参照[4],引物序列见表1,反应条件为:95℃预变性10 s;95℃变性5 s,60℃退火和延伸40 s,共40个循环。

用比较Ct值[5]来分析体外瘤胃发酵中添加和未添加中药提取液的情况下rfbE基因相对16S rDNA的量。样品扩增的rfbE基因和16S rDNA基因的 Ct值,用公式 RATE=2-ΔΔCt计算 rfbE 基因相对16S rDNA的量。采用SPSS 23统计软件上的单因素方差分析(ANOVA)和Duncan多重比较对数据进行统计学分析。

表1 相对定量PCR引物序列

1.7 半数致死量(LD50)的测定 使用大鼠进行急性经口毒性(LD50)试验,将40只大鼠随机分为5组,每组8只,雌雄各半,用不同浓度梯度的提取液灌胃,记录大鼠死亡数,用SPSS软件计算LD50值[6]。

2 结果与分析

2.1 中药提取液抑菌试验结果 中药的水提液和醇提液对E.coli O157:H7的牛津杯法抑菌试验结果如表2所示,泽漆、黄芪、黄连、虎杖、石斛、白芍、夏枯草等7种中药的水提液和醇提液都没有抑菌圈,对E.coli O157:H7没有抑制作用;厚扑的醇提液抑菌圈1.83 cm,水提液没有抑菌圈,表明厚扑醇提液有抑制E.coli O157:H7作用,而水提液没有;肉桂和黄芩相似,水提液的抑菌圈分别为0.66 cm和0.74 cm、醇提液的抑菌圈分别为2.89 cm和1.31 cm,说明肉桂和黄芩的水提液和醇提液对E.coli O157:H7都有抑制作用,但是它们的醇提液比水提液的抑菌作用强;丁香的水提液和醇提液的抑菌圈分别是2.37 cm和0.34 cm,可见它们都对E.coli O157:H7有抑制作用,但其水提液比醇提液抑菌作用强。根据抑菌圈直径大小分析,4种提取液对E.coli O157:H7存在有效抑制作用,强弱顺序为:肉桂醇提液>丁香水提液>厚扑醇提液>黄芩醇提液。

表2 中药提取液对E.coli O157:H7的抑菌效果,n=3)

表2 中药提取液对E.coli O157:H7的抑菌效果,n=3)

-:无结果;+:轻度抑菌;++:中度抑菌;+++:高度抑菌。抑菌圈直径为处理抑菌圈直径减去阴性对照抑菌圈直径

_______提取液 抑菌圈直径/cm 抑菌效果水提液泽漆 - -黄芪 - -黄连 - -虎杖 - -肉桂 0.66±0.06 +丁香 2.37±0.13 +++厚扑 - -黄芩 0.74±0.04 +石斛 - -白芍 - -____________夏枯草__________________________________________________________-_-泽漆 - -醇提液黄芪 - -黄连 - -虎杖 - -肉桂 2.89±0.10 +++丁香 0.34±0.04 +厚扑 1.83±0.07 ++黄芩 1.31±0.11 ++石斛 - -白芍 - -____________夏枯草__________________________________________________________-_-水--阴性对照_________________________________________________________乙醇_0.11±0.01_+_阳性对照_____青霉素___________________________________________3.06±0.12_+_+_+

2.2 体外瘤胃发酵物总DNA提取结果 通过OMEGA粪便DNA提取试剂盒提取体外瘤胃发酵内容物的总DNA,DNA片段完整,并且OD260/OD280比值在1.81至1.85之间,说明DNA比较纯。

2.3 相对定量PCR结果 本研究应用RT-PCR测定体外瘤胃发酵中E.coli O157:H7的rfbE基因相对总DNA中16S rDNA的量(2^-ΔΔCt),用来说明中药提取液在体外瘤胃发酵中对E.coli O157:H7的抑制情况。如表3所示,体外瘤胃发酵中添加厚朴醇提液,2^-ΔΔCt值为0.82,与对照的1.01 相比,没有显著差异(P>0.05);丁香水提液(0.19)、肉桂醇提液(0.10)和黄芩醇提液(0.42)的 2^-ΔΔCt值显著低于厚朴醇提液和对照(P<0.05),丁香水提液和肉桂醇提液的2^-ΔΔCt值也都显著低于黄芩醇提液(P<0.05),但丁香水提液和肉桂醇提液之间的值没有显著差异(P>0.05)。值的大小也表明各实验组中E.coli O157:H7相对量的多少。因此,在体外瘤胃发酵中,抑制E.coli O157:H7的强弱顺序为:肉桂醇提液>丁香水提液>黄芩醇提液>厚朴醇提液。

表3 E.coli O157:H7的rfbE基因的RT-PCR结果

2.4 半数致死量(LD50)测定结果 经试验,肉桂醇提液、丁香水提液、黄芩醇提液和厚朴醇提液对雌雄大鼠经口LD50均大于15 000 mg/kg体重。根据卫计委GB 15193.3-2014号公告的急性毒性(LD50)剂量分级标准,大于15 000 mg/kg体重为无毒,所以,肉桂醇提液、丁香水提液、黄芩醇提液和厚朴醇提液均属于无毒物。

3 讨论与小结

3.1 中药提取液抑菌试验结果 现代分析和医理实验证明,中药存在一些成分对金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌、大肠杆菌等均有明显的抑制作用[7],一般来说,这些中药抑菌都是广谱型的。张显忠等研究表明[8],丁香醇提液比水提液抑制的作用更强,这和本研究的结果相反,可能是张显忠等人丁香水提液是采用水煮法的原因,因为该法需要加热到100℃,致使丁香水提液中抑菌的活性物质失去活性。本研究结果显示,黄芩水提液和醇提液对E.coli O157:H7都有抑制作用,这与张莉等研究结果一样[9]。陈惠等[10]研究结果表明,肉桂醇提液抑菌能力强于肉桂水提液,这个结果也与本研究结果一致,不同的是本研究的结果是肉桂提取液抑菌能力强于丁香提取液,而陈惠等研究结果是丁香提取液抑菌能力强于肉桂提取液,这个不同结果应该是这两个研究中肉桂和丁香提取液制备过程中温度和乙醇浓度不同所致。本研究中,厚朴醇提液对E.coli O157:H7有中等抑菌效果,这与吴维萍的研究结果一致[11]。中药提取液的牛津杯抑菌试验结果表明,中药活性成分采用水提取和醇提取对E.coli O157:H7的抑制有完全不同的效果:醇提法更有效的作用极可能是由于提取液中除了水溶性的成分还有水不溶的酯类等活性成分[8]或只含有酯类活性成分,水提法更有效的作用极可能是由于提取液中抑菌活性成分只溶于水,而不易溶于乙醇。因为中药提取方法或工艺的不同,也会导致提取液的抑菌效果不同,所以对不同的中药应根据其所含活性成分的不同及目标产物的不同而选取最优的提取工艺,以达到最好的提取效果[9]。

3.2 体外瘤胃发酵物总DNA提取结果 体外瘤胃发酵内容物与土壤、沉积物不同,成分十分复杂,平常的DNA提取方法所得到的DNA通常不纯,含有色素、蛋白、RNA等杂质,因而影响后续的分子生物学实验。由于体外瘤胃发酵内容物与粪便相似,因此本研究选择OMEGA粪便DNA提取试剂盒提取体外瘤胃发酵物总DNA。结果,不论从DNA琼脂糖电泳图谱上看,还是从DNA的OD260/OD280比值上看,所提取的DNA质量都达到了后续分子生物学实验的要求。

3.3 相对定量PCR结果 通过体外瘤胃发酵和相对定量PCR实验来初步检验肉桂醇提液、丁香水提液、厚扑醇提液、黄芩醇提液在实际应用中对E.coli O157:H7的抑制效果,用来评估这些中药提取液抑菌的应用前景。当前,有一些研究检测 E.coli O157:H7的报道,基本都选择E.coli O157:H7的O157抗原基因rfbE作为检测E.coli O157:H7的检测靶基因,该基因具有极强的特异性,其编码大肠杆菌脂多糖(LPS)[4,12]。

在体外瘤胃发酵试验中,4种中药提取液对E.coli O157:H7的抑制效果与牛津杯法抑菌试验的结果一致。肉桂醇提液和丁香水提液对E.coli O157:H7抑制能力最强,但是仍然能够检测到 E.coli O157:H7的存在,说明提取液添加的量不足以杀死E.coli O157:H7,只是抑制了E.coli O157:H7的生长或过快生长。黄芩醇提液和厚朴醇提液对E.coli O157:H7抑制能力就要弱得多,其添加的体外瘤胃发酵中,依然有大量的E.coli O157:H7繁殖。如表3所示,肉桂醇提液(8.71)、丁香水提液(8.70)、黄芩醇提液(8.21)的16S rDNA Ct值显著高于对照(7.45),充分说明它们对体外瘤胃发酵中微生物的抑制如抗生素一样具有广谱性。

3.4 半数致死量(LD50)的测定结果 测定半数致死量能比较准确地反映出提取液的毒性大小:半数致死量与毒性成反比,即致死量越小,毒性越大;致死量越大,毒性越小[13]。本研究的肉桂醇提液、丁香水提液、黄芩醇提液和厚朴醇提液对大鼠经口LD50测定结果均大于15 000 mg/kg体重,可以确定这4种提取液均为无毒物,这个结果也说明这4种提取液作为反刍动物饲料添加剂,能够起到对病源菌的抑制作用,而对动物本身没有伤害。

研究结果表明,在供试的11种中药中,肉桂、丁香、厚扑和黄芩提取液对E.coli O157:H7有较强的抑制效果,并且无毒,其中丁香采用水提取法抑菌效果更佳,肉桂、黄芩和厚朴采用醇提取法抑菌效果更佳;肉桂醇提液和丁香水提液具有代替抗生素作为反刍动物饲料添加剂的应用前景。

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