模板法制备有序金纳米帽SERS活性基底及其在水产品违禁药痕量检测中的应用

史雅莉，郎咸忠*，马骥，蒋美萍**

（常州大学信息科学与工程学院、数理学院，江苏 常州 213164）

近年来，违禁抗菌药物滥用导致的水产品安全问题日益显著。水产品中残留的抗菌类药物不仅会使病原体产生耐药性，而且部分抗菌药物本身具有致癌、致突变等副作用[1]。特别是以结晶紫(crystal violet，CV)和孔雀石绿(malachite green，MG)为代表的三苯甲烷类染料(其分子结构见图1)，因价格低廉且具有良好的杀菌消毒作用而被大量应用于水产养殖业，它们对自然环境和人类身体健康构成极大的威胁[2]。目前，对该类物质较为成熟可靠的检测技术主要包括分光光度法[3]、高效液相色谱法(HPLC)[4]、液质联用法(LC–MS)[5]等。然而，这些技术大多基于大型固定探测设备，存在设备笨重、价格昂贵、分析时间长、检测种类单一等缺点，并且往往需要固相萃取等复杂的前期处理过程。

图1 两种三苯甲烷类染料的分子结构Figure 1 Molecular structures of two triarylmethane dyes

表面增强拉曼散射(surface-enhanced Raman scattering，SERS)[6]技术因具有灵敏度极高，信号响应迅速，检测范围广阔，对气体、液体和固体都能够直接进行高分辨的指纹式识别等传统技术无法比拟的诸多优势而备受关注[7-8]。SERS技术要求用于分子检测的化学、生物传感器材料具有宽广的动态响应范围和均匀稳定的响应信号，因而基底方面的研究一直是该领域的研究热点之一[9-11]。传统的SERS基底多采用表面经过粗糙化处理的贵金属电极或由贵金属纳米胶体颗粒构成的金属岛膜结构[12-13]。这些材料的共同特点是表面结构无序且不可控，难以在较宽的动态范围内获得可靠、稳定、均匀的SERS信号。为了解决这一问题，现代纳米刻蚀技术[14]被用于制备有序贵金属纳米阵列。然而，这些制备手段往往存在制备成本高昂、工序繁杂、难以大面积量产等诸多技术弊端，大规模应用于违禁药物痕量检测时受到限制。因此，寻求一种简单、低成本的方法，用以大面积制备有序可控的高灵敏度SERS基底，已成为目前亟待解决的关键问题[15]。

本文提出一种以多孔阳极氧化铝(PAA)阻挡层为模板，大面积制备有序可控的金纳米帽阵列的方法，并以该阵列作为SERS基底，对典型的水产品违禁药物CV和MG进行痕量分析。该方法操作简单、成本低廉，有望推广用于实际水产品违禁药物的痕量检测。

1 实验

1.1 金纳米帽阵列的制备

1.1.1 多孔阳极氧化铝的制备

1.1.1.1 铝箔的清洗与抛光

将高纯铝箔(99.99%)置于丙酮中超声清洗以去除表面油污，然后置于体积比为5∶1的乙醇和高氯酸混合溶液中进行电化学抛光，电压15 V，时间5 min。经去离子水冲洗并氮气吹干后，得到表面呈光滑镜面的铝箔。

1.1.1.2 两步氧化法制备PAA模板

将抛光后的铝箔置于0.5 mol/L的草酸溶液中，在不同的直流电压(20、30、40、50或60 V)下进行阳极氧化，时间为2 h，温度维持在10 °C。接着将样品置于75 °C的铬酸和磷酸等体积混合溶液中2 h以去除之前制备的氧化铝层，随后再次进行阳极氧化，时间和条件与第一次阳极氧化时相同，从而得到高度有序的PAA模板。

1.1.2 金纳米帽阵列的制备

将样品置于饱和氯化铜溶液中去除铝基底，使PAA的阻挡层暴露出来。利用电子束蒸发镀膜机将金沉积在PAA阻挡层表面，真空度为4 × 10−3Pa，沉积速率为0.5 Å/s，沉积厚度为30 nm，得到一系列高度有序的金纳米帽阵列。

1.2 形貌表征

采用美国Veeco公司的NanoScope V型原子力显微镜(AFM)观察PAA底部阻挡层的结构，采用日本JEOL公司的JSM-633F型场发射扫描电子显微镜(SEM)观察金纳米帽阵列的形貌。

1.3 SERS光谱检测

将金纳米帽阵列浸泡于CV和MG溶液中1 h，取出后吹干，用K-Sens型便携式光纤拉曼光谱仪(上海复享光学有限公司)进行SERS光谱检测，激光器的激发波长为532 nm，光谱分辨率小于5 cm−1。使用时通过调节拉曼探头的位置，使激光垂直入射并聚焦于基底表面。设置激光器输出功率为20 mW，时间20 s，积分2次。

2 结果与讨论

2.1 PAA表面结构表征

图2为40 V电压下制备的PAA底部阻挡层的AFM图像。可见阻挡层表面布满了六角密堆排列的半球状凸起结构，其形成归因于多孔阳极氧化铝在自组装生长过程中半球形电场和邻近孔洞之间机械挤压的共同作用[16-18]。这些凸起的尺寸较为均一，直径约为100 nm，并且相邻凸起之间存在一个自然的三角锥形凹槽，相邻单元之间的最小间隙小于10 nm。这样的纳米结构有利于构建具有均匀分布的高密度SERS增强“热点”[19-20]。

图2 典型的多孔阳极氧化铝阻挡层的三维AFM图像(阳极氧化电压为40 V)Figure 2 3D AFM image acquired from the barrier layer of a typical PAA substrate (anodization voltage = 40 V)

2.2 金纳米帽阵列的形貌表征与调控

由图3可见，金纳米帽阵列呈现近似六角密堆排列，具有较为均一的形貌和尺寸，其中以40 V和50 V氧化电压下制备的PAA为模板获得的金纳米帽阵列有序度最高。另外如图4所示，金纳米帽的直径(D)随着制备PAA模板时的阳极氧化电压(U)的增大而呈现近似线性增大的趋势，两者之间的线性关系近似为D = 2.355U + 6.226(相关指数R2= 0.93502 )。该变化规律与模板阻挡层尺寸随阳极氧化电压的变化规律一致[21]。相邻金纳米帽之间具有尺寸小于10 nm的三角锥形间隙，这对于形成有效“热点”，进而实现SERS信号增强极为重要。这种以PAA为模板的方法能够轻易实现厘米级有序金纳米帽阵列的制备，并有望被应用于制备大面积的SERS分子传感芯片。

图3 以不同电压下获得的PAA为模板制备的金纳米帽阵列的SEM照片Figure 3 SEM images of gold nanocap arrays templated by PAA prepared at different voltages

2.3 三苯甲烷类违禁药物的痕量检测

图4 金纳米帽的平均直径随PAA模板制备时阳极氧化电压的变化Figure 4 Average diameter of gold nanocap as a function of anodization voltage applied to preparation of PAA template

首先，选用有代表性的三苯甲烷类违禁药CV作为检测对象。将1 × 10−5mol/L的CV溶液自然吸附于以不同电压制备的PAA为模板所得到的金纳米帽基底上，然后检测SERS信号。将1 × 10−2mol/L的CV溶液自然吸附于沉积有30 nm金膜的载玻片上，作为对比参照。如图5所示，金纳米帽基底呈现了显著的拉曼信号增强，SERS光谱在300 ～ 1800 cm−1范围出现了许多尖锐的峰。最显著的几个峰的位置在919、1179、1380、1592和1624 cm−1处，其中919 cm−1和1179 cm−1处的峰归属于芳环上C—H面内弯曲振动耦合峰，1380 cm−1处的峰是由伸缩振动引起的。通过对比20 ～ 60 V的SERS基底产生的拉曼信号的相对峰强，发现40 V基底的增强效果最佳。该现象可归因于以40 V阳极氧化所得PAA为模板所制备的金纳米帽阵列上高度有序的高密度颗粒和适当的间隙产生了更强的“热点”。

图5 1 × 10−5 mol/L CV 溶液吸附于以不同电压进行阳极氧化所得PAA为模板制备的金纳米帽基底时以及1 × 10−2 mol/L CV 溶液吸附于平整金箔时得到的SERS光谱Figure 5 SERS spectra of 1 × 10−5 mol/L CV solution adsorbed on the gold nanocap arrays templated by PAA prepared at different anodization voltages and 1 × 10−2 mol/L CV solution adsorbed on a flat gold sheet

为了定量描述SERS基底的信号增强程度，选取较为显著的919 cm−1特征峰，按式(1)计算增强因子EF。

其中，ISERS和IRaman分别为违禁药物分子表面增强拉曼峰强和普通拉曼峰强，NSERS和NRaman分别为表面增强拉曼光谱和普通拉曼光谱测定时激光光斑下分子的数量(两者之比等于违禁药物分子的溶液浓度之比)。通过计算发现，以40 V阳极氧化所得PAA为模板制备的金纳米帽阵列的增强因子高达1.6 × 104，具有较高的检测灵敏度。因此，选取该金纳米帽阵列作为测定违禁药物的标准SERS基底。

接下来考察CV分子在该标准基底上SERS信号的重复性。将浓度为1 × 10−5mol/L的CV溶液吸附在它之上，并随机选取10个位置进行SERS信号检测，结果如图6所示。可见各个位置的SERS光谱的峰形、峰位和峰强几乎一致，具有较好的信号重复性。根据919 cm−1处的峰强计算其SERS信号的相对标准差约为8.9%，足见该SERS基底具有良好的均一性，有望应用于水产品违禁药物的定量检测。

图6 采用在40 V下阳极氧化所得PAA模板制备的金纳米帽阵列为基底测得的SERS信号的重复性Figure 6 Reproducibility of SERS spectra on the gold nanocap array templated by PAA prepared at an anodization voltage of 40 V

要实现违禁药物的半定量或定量的SERS检测，必须考察标准SERS基底的SERS信号对违禁药物浓度的动态响应。为了使研究分析更具有普适性，选用CV和MG这两种典型的三苯甲烷类违禁药物作为检测对象。将不同浓度的CV和MG溶液分别吸附于标准SERS基底上，分析其SERS信号随违禁药物溶液浓度变化的响应，结果如图7所示。可见违禁药物分子的SERS信号强度随着其溶液浓度的减小而降低，呈现了较大的动态响应范围，CV和MG分子的检测极限都可达到10−8mol/L。另外值得指出的是，CV与MG的分子组成和结构相近(见图1)，因此它们的SERS光谱相似，但通过对比拉曼特征指纹谱的峰位(如CV在346 cm−1处有明显的特征峰，而MG在该处没有；MG在1223 cm−1处有明显的特征峰，而CV在该处没有)很容易将两者的信号分辨出来。因此，采用SERS光谱技术有望实现真实环境中同时对多种违禁药物的快速检测。

图7 不同浓度的CV和MG溶液的SERS光谱Figure 7 SERS spectra of CV and MG solutions with different concentrations

为了更明确地分析SERS信号强度(以I来表示)对违禁药物的浓度(以c来表示)的动态响应，分别对CV的919 cm−1特征峰和MG的1182 cm−1特征峰的强度随溶液中两种分子的浓度的变化进行分析，对数据取对数后进行线性拟合，结果如图8所示。对于CV，lgI = −0.35477lgc + 5.5461，R2= 0.99669；对于MG，lgI = −0.38767lgc + 5.33774，R2= 0.97329。可见两种违禁药物分子的SERS特征峰强与分子浓度近似呈线性关系，这为以金纳米帽基底对违禁药物进行SERS痕量检测提供了一定的参考依据。

3 结论

以多孔阳极氧化铝阻挡层为模板，结合电子束蒸发技术，大面积地制备出一系列高度有序的金纳米帽阵列。通过改变制备模板时的阳极氧化电压，可对金纳米帽形貌进行调控，进而实现对其表面水产品违禁药物分子SERS信号的调控。结果发现，在以阳极氧化电压为40 V时制备的模板上获得的金纳米帽阵列对CV分子具有最强的SERS信号增强效果。该SERS基底不仅对CV分子的检测具有较高的增强因子和较好的重复性，且对水体中CV和MG违禁药物分子的SERS信号具有较宽的动态响应，信号强度与其浓度有明显的线性关系，检测极限可达到10−8mol/L。

图8 CV的919 cm−1特征峰和MG的1182 cm−1特征峰的强度分别随它们在溶液中浓度的变化Figure 8 Intensity of SERS signal for CV at 919 cm−1 and for MG at 1182 cm−1 as a function of their concentrations in test solutions

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