葶苈生脉方中黄芪、麦冬总皂苷的提取及其含量测定

李佳佳 郑文丽 张华潭 李春花

[摘要] 目的 研究葶藶生脉方中黄芪、麦冬皂苷的含量测定方法，并以其含量为指标优选黄芪、麦冬的最佳提取工艺。 方法 选用以香草醛-冰醋酸-高氯酸为显色剂，紫外分光光度法测定总皂苷的含量。采用正交试验法，以总皂苷的含量为评价指标，考察乙醇浓度、料液比和提取时间对提取工艺的影响，优选黄芪、麦冬的最佳提取工艺。 结果 本研究中黄芪甲苷在8.88～44.40 μg范围内呈良好的线性关系，精密度、稳定性、重现性试验的RSD值均≤1.19%，平均加样回收率为101.78%，RSD值为1.85%（n = 9）。最佳提取工艺：8倍量80%的乙醇回流提取2次，每次2 h。 结论 该方法操作简便，准确、重现性好，可作为葶苈生脉方中黄芪、麦冬皂苷质量控制的方法。

[关键词] 黄芪；麦冬；总皂苷；葶苈生脉方；提取工艺；正交试验

[中图分类号] R284.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）02（c）-0128-04

Extraction and content determination of total saponins from Astragali Radix and Ophiopogonis Radix in Tingli Shengmai Decoction

LI Jiajia1 ZHENG Wenli2 ZHANG Huatan3 LI Chunhua4

1.Grduate School， Hebei University of Chinese Medicine， Hebei Province， Shijiazhuang 050090， China； 2.Department of Pharmacy， Shijiazhuang Second Hospital， Hebei Province， Shijiazhuang 050051， China； 3.Shijiazhuang Keren Pharmaceutical Technology Co.， Ltd， Hebei Province， Shijiazhuang 050035， China； 4.College of Pharmacy， Hebei University of Chinese Medicine， Hebei Province， Shijiazhuang 050200， China

[Abstract] Objective To study the content determination method of total saponins from Astragali Radix and Ophiopogonis Radix in Tingli Shengmai Decoction， and to optimize the optimum extraction process of Astragali Radix and Ophiopogonis Radix taking the contents as indices. Methods The vanillic aldehyde-glacial acetic acid-perchloric acid was selected as color developing agent， and the contents of total saponins were detected by ultraviolet spectrophotometry. By using orthogonal experiment， taking the contents of total saponins as indices， the effects of ethanol concentration， solid-liquid ratio and extraction duration for the extraction process were investigated， so as to optimize the optimum extraction process of Astragali Radix and Ophiopogonis Radix. Results In this study， astragaloside Ⅳ showed a good linear relationship within the range of 8.88-44.40 μg， all the RSD values of degree of precision， stability and repeatability experiments were ≤1.19%， the average recovery rate was 101.78%， RSD was 1.85% （n = 9）. The optimum extraction process： reflux extraction of 8 times amount of 80% ethanol was taken for 2 times， once 2 h. Conclusion The method is simple， accurate and reproducible， which can be used as a method for the quality control of Astragali Radix and Ophiopogonis Radix in Tingli Shengmai Decoction

[Key words] Astragali Radix； Ophiopogonis Radix； Total saponins； Tingli Shengmai Decoction； Extraction process； Orthogonal experiment

葶苈生脉方是全国名老中医邢月朋治疗气虚血瘀、阳虚水停型充血性心力衰竭（CHF）的经验方，该方是由葶苈子、黄芪、麦冬、红参、五味子、桂枝、茯苓、白术、猪苓、泽泻、丹参、红花、川芎组成，被列为国家“十一五”科技支撑计划项目。为将葶苈生脉方开发为现代制剂，我们探索适于方中黄芪、麦冬工业生产的工艺参数。方中黄芪、麦冬含有皂苷类成分，且均为有效成分。现代药理研究已证实：黄芪皂苷有强心作用，尤以黄芪甲苷具有明显的正性肌力作用，可以改善心脏收缩和舒张功能[1-4]；麦冬皂苷对心肌细胞缺氧再给氧损伤具有保护作用[5-6]。文献中多为黄芪、麦冬单味药材的提取研究[7-10]，本研究将对黄芪、麦冬药对进行提取工艺的优化，为实际生产提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

TU-1900紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；电子天平（天津天平仪器有限公司，TD200/型）；分析天平（上海精科仪器厂，TG328B型）；超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，KQ-100E型）；立式电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司，DGF-4A型）；有机系（0.22 μm）微孔滤膜，旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂，RE-52型）；调温型电热套（北京科伟永兴仪器有限公司）。

1.2 药材与试剂

黄芪、麦冬药材购于石家庄乐仁堂，经河北中医学院侯芳洁讲师鉴定符合2015版《中国药典》一部相关项下规定。黄芪甲苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110781-200613）；甲醇（色谱纯，批号：A2005-0001）购于美国Grace公司；香草醛、冰醋酸、高氯酸、乙醇、正丁醇、氢氧化钠等均为分析纯，双蒸水（自制）。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

称取经五氧化二磷减压干燥的黄芪甲苷标准品适量，精密称定，置5 mL容量瓶中，甲醇溶解，定容，备用。得黄芪甲苷的浓度为0.4442 mg/mL。

2.2 供试品溶液的制备

根据组方配比，称取黄芪30 g；麦冬10 g ；黄芪30 g+麦冬10 g；分别加入6倍量80%乙醇，回流提取2次，每次2 h。合并提取液，分别减压回收乙醇144、48、192 mL。精密移取提取液5 mL，用水饱和正丁醇振摇萃取3次，每次7.5 mL，合并正丁醇层，后用0.1 mol/L的NaOH溶液洗涤正丁醇层2次，每次10 mL，蒸干回收正丁醇层，用甲醇溶解，置10 mL容量瓶，定容。精密吸取一定量的溶液，水浴蒸干，甲醇溶解，置25 mL容量瓶，定容，使每组溶液所含总生药量为0.02 g/mL[11-12]。

2.3 检测波长的确定

精密吸取上述标准品溶液0.6 mL，供试品溶液分别1 mL至具塞试管中，水浴挥干，分别精密加入新鲜配制的5%香草醛-冰醋酸0.2 mL，高氯酸0.8 mL，于60℃水浴加热15 min，取出立即冰浴5 min，加入5 mL冰醋酸。随行试剂为空白试剂，在350～800 nm处扫描。见图1。结果显示：对照品和供试品在470 nm处有最大吸收。样品的测定结果以黄芪甲苷为基准来测定黄芪、麦冬总皂苷的含量。

2.4 方法学考察

2.4.1 标准曲线的制备 分别吸取上述黄芪甲苷标准品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL，置5个具塞试管中，水浴挥干，按照“2.3”项下方法，在470 nm出测定吸收值，以含量（M，mg）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为：A = 13.6149 M - 0.0115，r = 0.9998（n = 5），线性范围为8.88～44.40 μg。结果表明，在线性范围内黄芪甲苷的含量与吸光度呈良好的线性关系。

2.4.2 精密度实验 精密吸取黄芪甲苷对照品溶液6份，每份0.6 mL，按照“2.3”项下方法测定在470 nm处的吸收值，计算RSD值。结果显示RSD值为0.44%（n = 6），表明该仪器精密度较好。

2.4.3 重复性实验 称取黄芪30 g、麦冬10 g，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，平行取6份，每份1 mL，置具塞试管中，按照“2.3”项下方法测定在470 nm处的吸收值，计算RSD值。结果显示RSD值为0.13%（n = 6），表明该方法重复性良好。

2.4.4 稳定性实验 精密吸取黄芪甲苷0.6 mL，“2.4.3”项样品溶液1 mL，置具塞试管中，按照“2.3”项下方法，分别于0、5、10、15、20、30 min测定在470 nm处的吸收值，计算RSD值。结果显示RSD值为1.19%，表明标准品溶液和供试品溶液显色后在30 min内稳定。

2.4.5 加样回收率实验 精密吸取已知含量的供试品溶液9份于10 mL容量瓶中，3份为一组，加入对照品溶液0.051、0.103、0.152 mL，甲醇定容，按照“2.3”项下方法测定在470 nm处的吸收值，计算RSD值。计算黄芪甲苷平均加样回收率分别为101.78%，RSD为1.85%（n = 9）。见表1。

2.5 正交试验优选黄芪、麦冬提取工艺

2.5.1 正交试验设计与结果 通过查阅大量文献，确定考察因素[13-16]，采用正交试验设计，以乙醇用量（A）、乙醇浓度（B）、提取时间（C）为考察因素，以总皂苷含量为评价指标，用L9（34）正交表安排实验，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.3”项下方法测定总皂苷含量，从而确定黄芪、麦冬总皂苷提取的最佳工艺，因素水平见表2，正交实验安排及结果见表3，方差分析表见表4。

2.5.2 最佳提取工艺的确定 从表2和表3可知：根据极差的大小，各因素對实验结果的影响顺序为B>C>A，即：乙醇浓度>提取时间>乙醇用量，方差结果显示，乙醇浓度对提取工艺具有显著性影响，而乙醇用量与提取时间对该工艺无显著影响。结合正交试验结果最佳提取工艺为A3B2C3。即为10倍量80%乙醇，提取2次，每次2 h。根据表2可知乙醇用量为次要影响因素，因此出于对资源节约、生产实际等方面的需要，确定乙醇的用量为8倍量。

2.5.3 最优提取工艺验证试验 按处方规定量称取黄芪、麦冬药材，共3份，依据确定的最优工艺参数进行验证试验，结果总皂苷的含量分别是7.036、7.235、7.195 mg/g，均比正交试验中的9组高，表明该研究确定的工艺稳定、可行。

3 讨论

比色法是测定总皂苷含量的经典方法[17-20]。常用的有香草醛-冰醋酸-高氯酸、香草醛-浓硫酸以及高氯酸三种显色方法[21]。本研究就曾通过比较三种方法的优劣，选择香草醛-冰醋酸-高氯酸为最佳的显色剂。原因是香草醛-浓硫酸法显色不稳定，重现性差，测定数据误差大，所以不能用于定量分析。而以高氯酸为显色剂时，黄芪甲苷标准品溶液最大吸收波长与黄芪麦冬提取液的最大吸收波长相差很多。香草醛-冰醋酸-高氯酸法，反应灵敏，黄芪甲苷标准品溶液与黄芪麦冬提取液的在470 nm处都有较强吸收，且重现性良好，因此选用此种显色剂和黄芪甲苷为标准品来测定总皂苷的含量。

总皂苷采用比色法进行含量测定时，对所需试剂的温度及时间对其影响较大[22]。如本研究中显色剂使用时应该新鲜配制，因为香草醛容易被氧化而逐渐分解，使得空白溶液颜色加深，所以在水浴过后30 min之内完成对总皂苷的含量测定，以免影响测定结果；其反应温度应控制在60℃，当温度过高且长时间加热时，可能会有多糖类成分造成干扰；这些因素都会对实验结果产生误差，因此这一过程操作应格外注意。

用水饱和的正丁醇萃取为了使其吸湿能力下降，萃取时不会将水中的化合物一并吸附，分层效果好，可防止萃取过程中产生的乳化现象，可以缩短萃取时间，提高萃取效率，后用0.1 mol/L的NaOH洗涤正丁醇层是用碱皂化反应不完全的酯类生成钠盐而易溶于水。

香草醛-冰醋酸-高氯酸显色原理是高氯酸使苷元的酚羟基氧化为羧基，增加一个双键结构，再经双键位移，双分子缩合等反应生成共轭双键系统，又在酸的作用下形成阳碳离子盐而显色。

本研究采用比色法测定皂苷的总含量，方法简单，准确易行，为葶苈生脉方中黄芪、麦冬皂苷的定量分析提供了快速、有效的分析方法。

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（收稿日期：2017-12-19 本文编辑：张瑜杰）