反相高效液相色谱法测定恩替卡韦口腔速溶膜剂中药物含量

魏腾 高莹 曹青日

[摘要] 目的 建立恩替卡韦反相高效液相色谱（RP-HPLC）分析方法，测定口腔速溶膜剂中药物含量。 方法 以聚乙烯醇/聚乙二醇接枝共聚物为成膜材料，溶剂浇注法制备恩替卡韦口腔速溶膜剂。采用Inertsil ODS-3 C18 （4.6 mm×150 mm，5 μm）色谱柱，以乙腈-水（3∶97）和乙腈为流动相A和流动相B，检测波长254 nm，流速1.0 mL/min，柱温25℃，进样量20 μL，利用梯度洗脱程序测定恩替卡韦口腔速溶膜剂中药物含量。 结果 恩替卡韦标准溶液线性回归方程为：A=52548.1316C-639.5153 （R2=0.9999），日内精密度为0.15%～0.56%，日间精密度为0.35%～1.36%，准确度为99.70%，定量限为0.31 ng，检测限为0.26 ng，且药物溶液在24 h内稳定。恩替卡韦口腔速溶膜剂中药物含量为（98.93±0.55）%。 结论 本研究RP-HPLC分析方法专属性强，精密度、准确度高，稳定性好，适用于恩替卡韦口腔速溶膜剂中药物含量测定。

[关键词] 反相高效液相色谱；恩替卡韦；口腔速溶膜剂；聚乙烯醇/聚乙二醇接枝共聚物；含量测定

[中图分类号] R927 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）02（c）-0019-05

Determination of drug content in entecavir-loaded orodispersible film by a reverse phase high performace liqiud chromatography

WEI Teng1 GAO Ying2 CAO Qingri1

1.College of Pharmaceutical Sciences， Soochow University， Jiangsu Province， Suzhou 215123， China； 2.MSD R&D; （China） Co.， LTD.， Beijing 100000， China

[Abstract] Objective To establish a reverse phase high performance liquid chromatography （RP-HPLC） method for the determination of drug content in entecavir-loaded orodispersible films （ODFs）. Methods The entecavir-loaded ODFs were prepared by using a solvent casting method with polyvinyl alcohol/polyethylene glycol graft copolymer as a film-forming agent. The RP-HPLC analysis was performed on an Inertsil ODS-3 C18 （4.6 mm×150 mm， 5 μm） column with mobile phases composed of acetonitrile-water （3∶97） and acetonitrile. The flow rate of mobile phase was 1.0 mL/min. The wavelength of UV detector was set at 254 nm and the injection volume was 20 μL. The column temparature was mantained at 25℃. The drug content of entecavir-loaded ODFs was analyzed by a gradient elution mode. Results The linear regression equation of entecavir standard solution was A=52548.1316C-639.5153 （R2=0.9999）. The intra-day precision was 0.15%-0.56%， the inter-day precision was 0.35%-1.36%， and the accuracy was 99.70%. The limit of detection was 0.31 ng and the limit of quantitation was 0.28 ng. The drug solution was stable within 24 h. The drug content of entecavir-loaded ODFs was （98.93±0.55）%. Conclusion The RP-HPLC method of entecavir shows high specificity， good precision， accuracy， and stability. This method is suitable for the detemination of drug content in entecavir-loaded ODFs.

[Key words] RP-HPLC； Entecavir； Orodispersible films； Polyvinyl alcohol/polyethylene glycol graft copolymer； Content determination

恩替卡韋为环戊基鸟嘌呤核苷类似物，是选择性抗HBV的口服核苷类药物[1-2]。恩替卡韦片剂（商品名：博路定）是由Bristol–Myers Squibb公司研发并于2005 年3月29日美国食品药品监督管理局（FDA）批准上市[3]，2005年11月15日经中国国家食品药品监督管理局批准在中国上市[4]。目前，临床上应用的恩替卡韦治疗慢性乙型肝炎（CHB）的剂型，主要有普通片剂、分散片以及胶囊剂。已有报道的新剂型包括软胶囊剂[5]、液体制剂[6]、滴丸[7]、肠溶剂[8]及固体分散体[9]等。口腔速溶膜剂是将一定剂量的有效成分溶于或分散在成膜材料中制成的制剂[10]，可在一分钟内于唾液中崩解，释放出有效成分，经口腔黏膜吸收，同时使药物经过吞咽后能在胃肠道内快速溶出并吸收[11]。口腔速溶膜剂与口腔崩解片、分散片等其它常规剂型相比，具有很多优势，如体积小，重量轻，便于携带运输和贮存，工艺简单，无水条件可服药等[12-13]。经多方文献调查研究，目前国内外文献中对恩替卡韦口腔速溶膜剂的研究，尚未见相关文献报道。本研究以聚乙烯醇/聚乙二醇接枝共聚物（Kollicoat？誖 IR）为成膜材料[14-15]，溶剂浇注法[16]制备新型恩替卡韦口腔速溶膜剂，并采用反相高效液相色谱对其进行分析方法建立和含量测定[17-18]。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪（岛津LC-2010A，日本），电子天平（型号：CP214，奥豪斯仪器上海有限公司），超声波清洗器（型号：KQ-300DE，昆山市超声波仪器有限公司），水浴锅（型号：88-1，常州国华电器有限公司），离心机（型號：H-1650，长沙湘仪离心机仪器有限公司），恒温振荡器（型号：SHZ-82，金坛市富华仪器有限公司），电热恒温鼓风干燥箱（型号：DHG-9140A，上海精宏实验设备有限公司）。

1.2 试药

恩替卡韦（批号：20150803，Eurapharm Inc.）；乙腈（批号：OCPA1H，色谱纯，Honeywell），聚乙烯醇/聚乙二醇（3∶1）接枝共聚物（Kollicoat？誖 IR，批号：757287240， BASF），甘油（批号：20150202，浙江遂昌惠康药业有限公司），海藻酸钠（批号：F20060424，国药集团化学试剂有限公司），二氧化钛（批号：1208101，北京凤礼精求商贸有限责任公司），甘露醇（批号：20150806，上海东土化工进出口有限公司），微晶纤维素-羧甲基纤维素钠混合物（CeolusTM RC-A591NF，批号：B444，旭化成株式会社），其它试剂均为分析纯。

2 实验方法与结果

2.1 膜剂的制备

取300 mg Kollicoat？誖 IR加入10 mL的蒸馏水中，放置于80℃水浴中充分搅拌溶解，待Kollicoat？誖 IR完全溶解后在超声仪上去除气泡，再分别依次加入5 mg恩替卡韦、45 mg甘油、60 mg海藻酸钠、5 mg二氧化钛、5 mg RC-A591NF等使其溶解在溶液中，磁力搅拌至溶液混合均匀，使其在超声仪上脱去气泡，将最后得到的浆液均匀涂布于2 cm×15 cm的不锈钢板上，置于60℃的电热恒温鼓风干燥箱内干燥大约2.5 h。静置放冷后从不锈钢板上慢慢剥离得到膜剂，裁剪成2 cm×3 cm膜剂5片。

2.2 分析方法建立

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Inertsil ODS-3 C18（4.6 mm×150 mm，5 μm），流动相A：乙腈-水（3∶97），流动相B：乙腈，检测波长：254 nm，流速：1.0 mL/min，柱温：25℃，进样量：20 μL[15]。梯度洗脱程序见表1。

2.2.2 专属性考察

使用乙腈-水（3∶97）混合溶剂，配制10 μg/mL的恩替卡韦对照品和供试品溶液。精密吸取20 μL，在上述色谱条件下注入高效液相色谱仪，考察恩替卡韦的HPLC分析方法专属性。结果表明，恩替卡韦保留时间约为11.5 min，无杂质峰对主药峰形成干扰，专属性强。见图1。

2.2.3 线性关系

精密称取恩替卡韦10 mg，置入10mL容量瓶加入适量用甲醇超声溶解，加甲醇稀释至刻度，摇匀。用流动相稀释配制成药物浓度分别为1.0、2.0、2.5、3.0、5.0、10.0 μg/mL的系列标准溶液。取标准溶液20 μL注入高效液相色谱仪，记录峰面积。以恩替卡韦浓度C（μg/mL）为横坐标，峰面积A为纵坐标进行标准曲线的绘制，得到线性回归方程：A=52548.1316C-639.5153，R2=0.9999。结果表明，在1.0～10.0 μg/mL浓度范围内线性关系良好。见图2。

2.2.4 精密度

2.2.4.1 日内精密度 精密移取标准品供试液适量于100 mL容量瓶，用流动相A（3%乙腈）定溶，配制成1、5、10 μg/mL的低、中、高三个浓度的溶液，在1 d内不同时间点重复进样5次，测定并计算其浓度，得日内精密度。结果表明，低、中、高三个浓度相对标准偏差均小于2%，日内精密度良好。见表2。

2.4.4.2 日间精密度 精密移取标准品供试液适量于100 mL容量瓶，用流动相A （3%乙腈）定溶，配制成1、5、10 μg/mL的低、中、高三个浓度的溶液，连续3天进样3个浓度的供试品，测定并计算其浓度，得日间精密度。结果表明，低、中、高三个浓度相对标准偏差均小于2%，日内精密度良好。见表3。

2.2.5 准确度

精密移取标准品供试液适量于100 mL容量瓶，用流动相A（3%乙腈）定溶，配制成1、5、10 μg/mL的低、中、高3个浓度的溶液各5份，再分别精密吸取各溶液20 μL注入高效液相色谱仪，记录峰面积，计算准确度。结果表明，低、中、高三个浓度条件下，准确度平均值为99.7%，准确度高。见表4。

2.2.6 定量限

精密移取1 μg/mL标准品供试液，稀释至样品溶液中主峰的响应值约为噪音水平的10倍。记录色谱图。当主峰的S/N=13.27时，得出本实验恩替卡韦定量限为0.31 ng。

2.2.7 检测限

精密移取1 μg/mL标准品供试液，稀释至样品溶液中主峰的响应值约为噪音水平的3倍。记录色谱图。当主峰的S/N=2.73时，得出本实验恩替卡韦定量限为0.26 ng。

2.2.8 溶液稳定性

精密称取恩替卡韦标准品5.04 mg，于1000 mL容量瓶配制成标准溶液，分别于室温放置0、2、4、6、8、10、12、24 h后按上述色谱条件进样，计算RSD。结果见表5。结果表明，恩替卡韦溶液在24 h内稳定。

2.3 含量测定

裁取尺寸2 cm×3 cm的薄膜（n=3），置于100 mL的容量瓶，用适量流动相A（3%乙腈）溶解定溶。放置15分钟，取3 mL溶液，12000 r/min离心10 min，再进行HPLC分析，计算出其含有的药物含量为（98.93±0.55）%。

3 讨论

虽然恩替卡韦常规制剂已上市，但在服用时通常需要饮水，这对在无水条件下或具有吞咽困难的患者用药十分不便。为了提高药物快速起效，同时提高患者的顺应性，研究一种新型口腔速溶膜剂具有十分重要的科学意义。已有文献报道表明，采用HPLC或HPLC-MS方法，可有效测定恩替卡韋原料药和制剂的含量及有关物质[17-23]。但是迄今为止，尚未见到恩替卡韦口腔速溶膜剂及含量测定相关文献报道。

①本研究以Kollicoat？誖 IR为水溶性成膜材料，以甘油为增塑剂，海藻酸钠为崩解剂，二氧化钛为遮光剂，RC-A591NF为助悬剂，水为溶剂，采用溶剂浇注法成功制得恩替卡韦口腔速溶膜剂。

②本研究通过RP-HPLC分析方法学建立。所得恩替卡韦标准溶液线性回归方程为：A=52548.1316C-639.5153，R2=0.9999，表明恩替卡韦在1.0～10.0 μg/mL的范围内呈现良好的线性关系。低、中、高三种浓度的标准溶液，日内精密度为0.15%～0.56%，日间精密度为0.35%～1.36%，准确度为99.70%，且供试品溶液在24 h内稳定，所测口腔速溶膜剂的药物含量为（98.93±0.55）%，与理论值基本一致，符合质量要求。本研究RP-HPLC方法专属性强，精密度、准确度高，稳定性好，可用于恩替卡韦口腔速溶膜剂的含量测定及质量控制。

[参考文献]

[1] 朱玫，姚光弼.恩替卡韦[J].肝脏，2003，8（2）：1-2.

[2] Levine S，Hernandez D，Yamanaka G，et al. Efficacies of ent？鄄icavir against lamivudine-resistant hepatitis B virus replication and recombinant polymerases in vitro [J]. Antimicrob Agents Chemother，2002，46（8）：2525-2532.

[3] Bernard EJ.US approves new HBV drug. IAPAC Mon，2005，11：110.

[4] 李霖，李玉珍.抗乙肝病毒新药-恩替卡韦[J].新药与临床，2006，4（4）：56-58.

[5] 北京阜康仁生物制药科技有限公司.恩替卡韦软胶囊及其制备方法：中国，1732943A[P].2006-02-15.

[6] 布里斯托尔-迈尔斯斯奎布公司.低剂量液体恩替卡韦制剂和用途：中国，1658844A[P].2005-08-24.

[7] 北京阜康仁生物制药科技有限公司.恩替卡韦滴丸及其制备方法：中国，1732945A[P].2006-02-15.

[8] 杨喜鸿.恩替卡韦的肠溶制剂及其制备方法：中国，1883459A[P].2006-12-27.

[9] 湖南千金协力药业有限公司.一种恩替卡韦固体分散体和一种恩替卡韦制剂：中国，106727339A[P].2017-05-31.

[10] 崔福德.药剂学[M].2版.北京：中国医药科技出版社，2011.

[11] Xu LL，Shi LL，Cao QR，et al. Formulation and in vitro char？鄄acterization of novel sildenafil citrate-loaded polyvinyl alcohol-polyethylene glycol graft copolymer-based orally dissolving films [J]. Int J Pharm，2014，473（1-2）：398-406.

[12] 黄胜炎.速溶膜剂[J].上海医药，2005，26（7）：305-306.

[13] 赵伟，康静，王红霞.口腔速溶膜剂及其应用[J].天津药学，2013，25（4）：62-63

[14] 曹青日，施丽丽，徐卫娟，等.一种口腔速溶膜剂及制备方法：中国，102824333[P].2014-05-14.

[15] 曹青日，施丽丽，崔京浩.西地那非口腔速溶膜剂及制备方法：中国，103989661[P].2014-08-20.

[16] 李德秋.世界口腔溶膜生产技术开发新进展[J].黑龙江医药，201l，24（3）：439

[17] 蒋银妹，罗秀琴，徐燕，等.梯度洗脱反相高效液相色谱法测定恩替卡韦的有关物质[J].药物分析杂志，2009， 29（4）：676-679.

[18] 霍晓方，罗林，付超，等.HPLC法测定恩替卡韦原料药含量及其有关物质[J].中国药房，2008，19（16）：1254-1255.

[19] 陶玲，黄芳，宋伟峰，等.LC-MS法分析恩替卡韦口服制剂中的有关物质[J].分析测试学报，2014，33（3）：362-366.

[20] 冀满丰.高效液相色谱-梯度洗脱法测定恩替卡韦分散片的含量和有关物质[J].中国药学，2012，21（9）：26-27.

[21] 刘绪林，张永玲.HPLC测定恩替卡韦原料药含量及有关物质[J].中国保健营养，2013（2）：293-294.

[22] 易毛，韩晋，吴素体，等.HPLC法测定恩替卡韦分散片中恩替卡韦的含量[J]. 解放军药学学报，2012，28（6）：520-522.

[23] 张莲莲.恩替卡韦胶囊的含量测定[J].海峡药学，2007， 19（10）：78.

（收稿日期：2017-11-25 本文编辑：李岳泽）