HPLC法同时测定白术中白术内酯Ⅰ Ⅱ Ⅲ的含量

邝俊维 卿萍 周子虬 邹辉

摘 要 本研究建立了同时测定中药白术中白术内酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ含量的高效液相色谱法，结果表明白术内酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ进样量分别在76～760 ng，87～870 ng，75～750 ng范围内线性关系良好，白术甲醇超声提取液中白术内酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ平均加样回收率分别为100.20%（RSD=1.8%），100.10%（RSD=1.2%），99.68%（RSD=0.84%），白术甲醇回流提取液中白术内酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ平均加样回收率分别为100.67%（RSD=0.88%），100.06%（RSD=0.67%），100.67%（RSD=1.7%）.该含量测定方法简单、快速、准确、灵敏度高、重复性好，可用于白术药材的质量控制.超声提取法对白术内酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ的提取效率均高于加热回流提取法.

关键词 白术；高效液相色谱法；白术内酯Ⅰ；白术内酯Ⅱ；白术内酯Ⅲ；含量测定

中图分类号 R917文献标识码 A文章编号 1000-2537（2017）06-0055-06

Abstract In this work， a HPLC method has been established to simultaneously determine atractylenolideⅠ， Ⅱ， and Ⅲ in Atractylodes macrocephala Koidz. Our method has generated good linearity in the range of 76～760 ng，87～870 ng， and 75～750 ng for atractylenolideⅠ，Ⅱ， and Ⅲ，respectively. The average recoveries for these three compounds were 100.20%（RSD=1.8%）， 100.10%（RSD=1.2%）， and 99.68%（RSD=0.84%）by ultrasonic extraction， and 100.67%（RSD=0.88%）， 100.06%（RSD=0.67%）， and 100.67%（RSD=1.7%）by heating reflux extraction， respectively. The proposed method is simple， fast， accurate and reproducible， and can be used to control the quality of Atractylodes macrocephala Koidz. The ultrasonic extraction method shows higher extraction efficiency than the heating reflux extraction method.

Key words Atractylodes macrocephala Koidz； HPLC； atractylenolide Ⅰ； atractylenolide Ⅱ； atractylenolide Ⅲ； content determination

白术为菊科植物白术（Atractylodes macrocephala Koidz）的干燥根茎，为2015年版《中国药典》收录的国标药材，其性味苦、甘，温，归脾、胃经，主治脾虚、胎动不安等[1].主产于浙江、安徽、淮北、皖南等地，为地道药材“浙八味”之一，是藥用处方中的常用药材，其主要活性成分为白术内酯类成分[2-3]，此外还有苷类[4]和多糖类成分[5]；近年来，研究者从白术中发现了系列多炔类成分[6]，并证实其具有显著的抗炎作用[7].研究显示白术具有抗衰老[8]、抗肿瘤[9-10]、镇痛[11]等药理作用.

白术内酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ是白术中含量较高的化学成分，亦是白术的特征性成分，并且药理研究表明白术内酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ是白术的主要药效成分[12-15]，这3种成分的含量可作为白术质量控制的指标成分.本文建立了可同时测定白术内酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ含量的HPLC方法，并考察了不同提取方法对这3种成分含量的影响，为完善白术的质量控制提供科学依据.

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津高效液相色谱仪（日本岛津公司，配备低压四元泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器、色谱工作站）；FB224自动内校电子分析天平（0.000 01 g，上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；KQ5200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；RH-800型高速多功能粉碎机（浙江荣浩工贸有限公司）；不锈钢冲框标准筛（孔径250 μm，即60目，长沙市思科仪器沙筛厂）.

1.2 试药

白术药材饮片（批号16012009，购自湖南衡岳中药饮片有限公司）；白术内酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ对照品（自制，经HPLC检测，归一法计算纯度>99.0%）；甲醇（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司），乙腈（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；纯水（经0.45 μm水系滤膜过滤），其余试剂为分析纯.

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

分别精密称取白术内酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ对照品于10 mL容量瓶中，加适量甲醇溶解，定容至10 mL，制成浓度分别为1.869，1.912，2.178 g/L的单一对照品储备溶液；精密吸取各单一对照品储备液2 mL定容至25 mL，得白术内酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ浓度分别为0.149 5，0.153 0，0.174 2 g/L的混合对照品储备液，备用.

2.2 供试品溶液的制备

白术饮片粉碎后过筛，取白术药材细粉2份，各约1.0 g，精密称定，分别置于50 mL具塞锥形瓶中，精密量取2份甲醇各50 mL，分别加入上述锥形瓶中，微微振摇，称定质量.一份超声60 min，另一份水浴回流60 min，待冷却后，加甲醇补足溶剂挥发的量，摇匀.将提取的2份供试品溶液先用普通漏斗过滤，取续滤液分别置于50 mL锥形瓶中备用，在进样前用0.45 μm微孔滤膜滤过.

2.3 色譜条件及系统适应性

色谱柱：Agilent C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水，梯度洗脱；洗脱程序：0～15 min，乙腈55%，15～30 min，乙腈55%～80%；检测波长：220 nm（白术内酯Ⅰ，Ⅲ），276 nm（白术内酯Ⅱ）；进样量：20 μL；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃.

2.4 方法可行性考察

取白术对照品溶液及供试品溶液进行分析，按“2.3”项下色谱条件进样，得色谱图（见图1～3），白术内酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ对照品的保留时间分别为9.3，16.0，23.1 min，各成分均达到基线分离，具有较好的对称性，分离度均大于1.5，白术内酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ的理论塔板数均大于5 000.

2.5 线性关系考察

精密吸取“2.1”项下混合对照储备液0.5 mL加适量甲醇溶解后定容至10 mL，配制成白术内酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ分别为7.475，7.65，8.71 mg/L的混合溶液.按既定方法在色谱系统中分别进样10，20，40，60，80，100 μL测定.以峰面积A对进样量X （ng）进行线性回归，求得各自的线性回归方程为：白术内酯Ⅰ，Y=3 346.2X-27 657（r=0.998 7），线性范围为76～760 ng；白术内酯Ⅱ，Y=3 616 X-48 059（r=0.999 4），线性范围为87～870 ng；白术内酯Ⅲ，Y=3 242X+1 548（r=0.999 9），线性范围75～750 ng.

2.6 精密度实验

在“2.3”项的色谱条件下，对供试品溶液重复进样6次，进样量每次20 μL，分别测定白术内酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ的峰面积，计算RSD分别为0.28%，0.26%，0.16%，表明仪器精密度良好.

2.7 重复性实验

取同一批次的白术饮片细粉12份，每份约1.0 g，精密称定，其中6份按超声提取方法制成供试品溶液，6份按回流提取方法制成供试品溶液，按“2.3”项的色谱条件色谱条件进样，测得超声提取供试品溶液中白术内酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ含量的RSD分别为2.5%，2.0%，2.8%，回流提取白术供试品溶液中白术内酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ含量的RSD分别为0.74%，2.2%，2.0%，表示该方法重复性良好.结果见表1，2.

2.8 稳定性实验

分别取“2.2”项下制备得到的两种供试品溶液，在0，2，4，6，8，12和24 h进样，测定峰面积，计算得到超声提取白术供试品溶液的白术内酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ峰面积的RSD分别为1.4%，2.1%，2.4%，回流提取白术供试品溶液的白术内酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ峰面积的RSD分别为0.76%，2.7%，2.4%，结果表明两种供试品溶液在24 h内稳定性良好.结果见表3，4.

2.9 加样回收率

取已按既定方法测定含量的白术细粉12份，每份约1.0 g，精密称定，其中6份置于50 mL具塞锥形瓶中，分别精密加入混合对照储备液2.0，2.5，3.0 mL，加甲醇至50 mL，按超声提取方法制成供试品溶液；另6份置于250 mL圆底烧瓶中，分别精密加入混合对照储备液2.0，2.5，3.0 mL，加甲醇至50 mL，按回流提取方法制成供试品溶液；按“2.3”项的色谱条件下进样，分别测定两种提取方法下3种成分的含量，计算回收率.结果超声提取白术供试品溶液白术内酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ的平均加样回收率分别为100.20%（RSD=1.8%），100.10% （RSD=1.2%），99.68% （RSD=0.84%）；回流提取白术供试品溶液白术内酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ平均加样回收率分别为100.06（RSD=0.88%），100.30（RSD=0.67%），100.67（RSD=1.7%），结果见表5，6.

2.10 样品含量测定

取同一批次的白术细粉6份，其中3份按超声提取方法制成供试品溶液，另3份按回流提取方法制成供试品溶液，按“2.3”项的色谱条件下进样，用峰面积外标法计算白术内酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ含量，测定结果见表7，8.

3 讨论

3.1 检测波长选择

对白术内酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ对照品在190～800 nm进行紫外可见光谱扫描，结果显示白术内酯Ⅰ和Ⅲ在220 nm波长有最大吸收，而白术内酯Ⅱ在276 nm有最大吸收波长，故确定220 nm为白术内酯Ⅰ和Ⅲ的检测波长，276 nm为白术内酯Ⅱ的检测波长.

3.2 研究意义

本文建立了同时测定中药白术中3种主要活性成分的HPLC方法，为白术质量控制提供了实验依据.在该方法下，分别检测了超声提取与加热回流2 种提取方法下白术内酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ的含量.结果表明，超声提取中白术内酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ的含量均高于加热回流提取，而且超声提取较加热回流提取具有操作简单、方便、无需特殊装置，相对高效等优势，因此，本研究为选择白术有效成分的提取方法提供了科学依据.

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