几种色素抑制过氧亚硝酸根损伤酪氨酸能力的对比

张辰暘 魏安琪 王妍 谢子奇 罗云敬

摘 要 过氧亚硝酸根可以通过强氧化性及强硝化性损伤酪氨酸，从而损害人体健康.姜黄素、原花青素、槲皮素和柚皮素具有抗氧化、抗硝化性，但其自身颜色在研究酪氨酸硝化损伤的常规方法中易造成干扰.为测定色素抑制3-硝基酪氨酸生成的能力，使用高效液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC-PDAD， High Performance Liquid Chromatography-Photodiode Array Detector）法对硝化损伤体系成分进行分离，使用荧光光谱法测定色素抑制酪氨酸二聚体生成能力，邻苯三酚自氧化法测定超氧根阴离子抑制能力.结果表明3-硝基酪氨酸抑制率从大到小为姜黄素、原花青素、柚皮素、槲皮素、VC；酪氨酸二聚体抑制率从大到小为原花青素、姜黄素、柚皮素、槲皮素、VC；邻苯三酚自氧化抑制率从大到小为姜黄素、槲皮素、柚皮素、VC，原花青素无明显影响.分析表明4种色素成分抗氧化、抗硝化能力与其结构密切相关.

关键词 高效液相色谱-二极管阵列检测器；荧光光谱法；过氧亚硝酸根；酪氨酸损伤；黄酮类色素

中图分类号 Q55文献标识码 A文章编号 1000-2537（2017）06-0034-06

Abstract Peroxynitrite has strong oxidized and nitrified ability which can damage tyrosine and do harm to human health. Curcumin， proanthocyanidins， quercetin and naringenin are resistant to oxidation and nitrification. However， they are easily disturbed tyrosine damage detection in conventional methods. In this paper， the components of the nitrified injury system were separated and the ability of the pigments to inhibit 3-nitrotyrosine was determined by using HPLC-DAD. The inhibitory rates of dimer-tyrosine and the ·O-2 from pyrogallol autoxidation were determined by fluorescence spectroscopy. The results showed 3-nitrotyrosine inhibition rate： Curcumin > Proanthocyanidins > Naringenin > Quercetin； Dimer-tyrosine inhibition rate： Proanthocyanidins> Curcumin > Naringenin > Quercetin； pyrogallol autoxidation inhibition rate： Curcumin > Naringenin > Quercetin， while proanthocyanidins have no significant effect. The results showed that the anti-oxidized and anti-nitrified ability of four pigments components were closely related to their structures.

Key words HPLC-PDAD； fluorescence spectrometry； peroxynitrite； tyrosine damage； flavonoid pigments

人體处于亚健康状态时过量累积的超氧根阴离子自由基（·O-2）与一氧化氮自由基（NO·）能够结合生成具有强氧化性、强硝化性的过氧亚硝酸根自由基（Peroxynitrite， ONOO-， PN），ONOO-在中性条件下（pH=7.4）的半衰期为1.9 s，并且能够在纳摩浓度上保持较长的稳定[1]，同时具有强氧化性与强硝化性，因而其扩散能力、损伤能力均高于·O-2与NO·. ONOO-诱导酪氨酸硝化损伤的产物3-硝基酪氨酸（3-NT）除可作为蛋白质硝化损伤标志物外，其自身累积也会造成体内氧化应激损伤的增强[2-3].ONOO-还可在催化剂作用下氧化损伤酪氨酸生成酪氨酸二聚体[4]，从而影响蛋白质的生理结构.因此，研究过氧亚硝酸根的氧化、硝化抑制剂，对于维持生物大分子正常生理功能、预防疾病、保护人体健康具有重要意义.

近年来食品工业高度发达，食用色素的使用十分广泛，研究表明黄酮类、多酚类天然食用色素具有良好的抗氧化功能[5-10]，张迪[11]、赵静[12]等验证了原花青素、槲皮素与柚皮苷的抗氧化能力，鲁吉珂[13]、周丽娟[14]、周舒文[15]等研究了姜黄素抗氧化、清除自由基的能力，但对于食用色素成分抑制过氧亚硝酸根损伤酪氨酸的能力的研究报道较少.由于色素成分自身颜色在常规紫外分光光度法中易造成干扰，并且自由基损伤酪氨酸实验体系成分较为复杂，本文利用高效液相色谱法对体系成分进行分离，研究对比姜黄素、原花青素、槲皮素和柚皮素抑制过氧亚硝酸根诱导酪氨酸硝化的能力；使用荧光光谱法探究4种色素抑制过氧亚硝酸根氧化损伤酪氨酸的能力，并使用邻苯三酚自氧化法探究其抗氧化机理，实验使用维生素C（VC）作为阳性对照.

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

e2695高效液相色谱仪（美国Waters公司），SunFireRM C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）色谱柱（美国Waters公司），U-3010紫外-可见分光光度计（日本日立公司），SH-3数显恒温磁力搅拌器（北京金紫光科技发展有限公司），KQ-500DB数控超声波清洗器（昆山市超声仪器公司），PHS-25数显酸度计（上海精密科学仪器公司），DKB-450A电热恒温水槽（上海森信试验仪器有限公司），BS-210S电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司），PR020XXM1纯水机（北京PALL纯水公司），DL-300掌上离心机（北京鼎国生物公司），SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（上海科升仪器有限公司），F-4500荧光分光光度计（日本日立公司）.

亚硝酸异戊酯购于国药集团化学试剂有限公司，正己烷（色谱纯）、过氧化氢（30%）、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、维生素C、焦性没食子酸和无水乙醇购于天津市福晨化学试剂厂，二氧化锰、氢氧化钠、亚硫酸氢钠和盐酸购于北京化工厂，L-酪氨酸、L-3-硝基酪氨酸、甲醇（色谱纯）、姜黄素、槲皮素、柚皮素购于上海安谱科学仪器有限公司，三羟甲基氨基甲烷、氯化血红素购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，原花青素购于北京普天同创生物科技有限公司.试剂除标注外均为分析纯，实验用水均为二次去离子水.姜黄素、槲皮素、柚皮素使用无水乙醇配置为1×10-3 mol/L的储备液，原花青素、VC使用去离子水配置为1×10-3 mol/L的储备液.

1.2 过氧亚硝酸根溶液的制备

过氧亚硝酸根溶液使用UPPU与PRYOR的方法制备[16]，由过氧化氢与亚硝酸异戊酯发生取代反应生成，使用前用0.1 mol/L的氢氧化钠溶液稀释，使用紫外-可见分光光度计测定过氧亚硝酸根浓度.

1.3 HPLC法对几种色素抑制过氧亚硝酸根诱导酪氨酸硝化的研究

1.3.1 3-硝基酪氨酸标准曲线的制作 准确称取3-硝基酪氨酸标准品11.3 mg，使用0.05 mmol/L的磷酸盐缓冲溶液（pH=7.4）定容至50 mL，然后分别稀释至10，50，100，200，500和1 000 μmol/L.分别取上述溶液1 mL过0.22 nm有机相微孔滤膜进液相进行检测，以3-硝基酪氨酸浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线.色谱条件：色谱柱选择SunFireRM C18反相色谱柱，其规格为4.6 mm×150 mm，粒径5 μm.流动相V（甲醇）∶V（PBS）=1∶9（pH=7.4），流速1.0 mL/min，进样量10 μL，柱温37 ℃，检测波长420 nm.

1.3.2 姜黄素等对过氧亚硝酸根诱导的3-NT生成的影响 在棕色EP管中加入1.5 mL浓度为1 mmol/L的酪氨酸溶液，随后加入不同体积的浓度为1×10-3 mol/L的姜黄素溶液，使其终浓度分别为0，3.3，10.0，16.6，23.3，33.3，50.0和66.6 mmol/L，使用PBS溶液补齐至2.8 mL，混合物于37 ℃水浴孵育5 min后加入200 mmol/L的ONOO-溶液，于37 ℃水浴搅拌反应6 h.原花青素、槲皮素、柚皮素和维生素C实验组做相同处理.色谱条件同1.3.1.

1.4 荧光法对几种天然色素对过氧亚硝酸根诱导酪氨酸氧化的抑制作用研究

1.4.1 二聚体-过氧亚硝酸根标准曲线 在生理条件下（pH7.4的Tris-HCl缓冲溶液，37 ℃），酪氨酸浓度为1.0×10-3 mol/L，氯化血红素1.0×10-6 mol/L，只改变ONOO-的浓度（浓度范围为1.0×10-6～2.0×10-3 mol/L），制作标准曲线，荧光光谱仪主要参数：扫描模式Emission，数据模式Fluorescence，激发波长317 nm，发射波长范围350～500 nm，扫描速度1 200 nm/min.

1.4.2 姜黄素等对过氧亚硝酸根诱导的酪氨酸二聚体生成的影响 在10 mL塑料离心管中分别加入500 μL酪氨酸（1.0×10-3 mol/L），50 μL氯化血红素（1.0×10-6 mol/L），不同体积的姜黄素（1.0×10-3 mol/L），使用Tris-HCl缓冲溶液（pH 7.4）补齐体积至4 950 μL，以无水乙醇作为空白对照，最后加入50 μL的ONOO-溶液启动反应（ONOO-的浓度每次通过紫外分光光度计测定其含量，并稀释到1.0×10-2 mol/L），瞬间手持涡旋10 s，随后于37 ℃水浴中反应20 min.反应完成后取3 mL于1 cm比色皿中，测定反应液荧光强度.原花青素、槲皮素、柚皮素和维生素C实验组做相同处理.荧光光谱仪主要参数同1.4.1.

1.5 荧光法测定天然色素对邻苯三酚自氧化反应的抑制作用

取2.80 mL pH=8.2 的Tris-HCl 缓冲液，0.10 mL 三蒸水一同放入一5 mL比色管中，另取0.10 mL 邻苯三酚溶液（60 mmol/L）放入另一5 mL比色管中，将两比色管同时放入25 ℃水浴中保温20 min.随后，将两比色管中溶液迅速混合后快速摇匀，静置30 s后于1 cm比色皿中放入荧光光谱仪检测，记录激发波长446 nm、发射波长502 nm光谱条件下的荧光动力学曲线.该曲线0～5 min 部分的斜率为V0.将0.10 mL 水换为不同浓度的姜黄素溶液，荧光动力学曲线的斜率为Vs.添加原花青素、槲皮素、柚皮素及维生素C实验组按照上述实验条件做同样处理.荧光光谱主要参数：扫描模式Time，数据模式Fluorescence，激发波长446 nm，发射波长502 nm.

2 结果与讨论

2.1 几种色素对过氧亚硝酸根诱导酪氨酸硝化的抑制作用

2.1.1 3-NT标准曲线 在本文色谱条件下，3-硝基酪氨酸（3-NT）色谱峰与其他峰明显分開，可以对其进行准确定量.标准曲线y=18.968x-0.158 7，R2=0.999 6，线性关系良好.

2.1.2 几种色素成分对过氧亚硝酸根诱导酪氨酸硝化的色谱分析

由图1可以看出，在加入姜黄素、原花青素、槲皮素和柚皮素的体系中，酪氨酸硝化损伤产物3-NT的生成量随色素加入量增加而不同程度地降低，并且对比VC下降趋势更加明显.

2.1.3 色素成分对过氧亚硝酸根硝化酪氨酸的抑制作用 以谱图中对应位置处峰面积参照3-NT标准曲线计算浓度，按式（1）计算天然产物对ONOO-损伤的抑制能力，所得结果见表1.

抑制率=（1-I2/I1）×100%，（1）

式中：I1為未添加食用色素时ONOO-诱导酪氨酸硝化生成3-NT的浓度；I2为添加食用色素时ONOO-诱导酪氨酸硝化生成3-NT的浓度.

分析发现，在本文浓度范围内姜黄素、原花青素、槲皮素及柚皮素对于过氧亚硝酸根引发的酪氨酸硝化损伤均有不同程度的抑制作用，抑制能力从大到小为姜黄素、原花青素、柚皮素、槲皮素、VC.浓度为10 μmol/L时，姜黄素抑制率仍达到72.52%，原花青素为57.56%，槲皮素、柚皮素均在48.5%左右，而同样浓度的VC抑制率仅12.38%，较低浓度的4种色素表现出良好的抗硝化活性.姜黄素分子中具有多个功能基团，如两个苯丙烯酰基骨架、苯环上的酚羟基与甲氧基及丙烯基、β-双酮/烯醇式结构的连接，使其具有良好的抗硝化活性[17].

2.2 几种色素对过氧亚硝酸根诱导酪氨酸二聚体生成的抑制

2.2.1 二聚体-过氧亚硝酸根标准曲线 以过氧亚硝酸根浓度为横坐标，二聚体荧光值为纵坐标制作标准曲线，标准曲线y=3.738x+306.8，R2=0.996，线性关系良好.

2.2.2 几种色素对过氧亚硝酸根诱导酪氨酸氧化的荧光光谱分析 4种色素对于过氧亚硝酸根诱导的酪氨酸氧化均具有不同程度的抑制作用，抑制能力与色素浓度呈正相关（图2），其中姜黄素作用最为明显，不同浓度姜黄素抑制酪氨酸二聚体生成的荧光光谱见图2（a）.

2.2.3 色素成分对过氧亚硝酸根诱导酪氨酸氧化的抑制作用 以光谱图中λex/em=317/408 nm处的荧光值，参照二聚体-过氧亚硝酸根浓度标准曲线，计算ONOO-浓度，按公式（2）计算天然色素的抑制率，所得结果见表2.

式中：I1为未添加天然色素时ONOO-诱导酪氨酸氧化生成酪氨酸二聚体的浓度；I2为添加天然色素时ONOO-诱导酪氨酸氧化生成酪氨酸二聚体的浓度.

结果表明，姜黄素、原花青素、槲皮素及柚皮素对过氧亚硝酸根氧化酪氨酸均具有不同程度的抑制作用.随着几种天然色素的浓度不断增加，酪氨酸二聚体的生成量逐渐减少，抑制作用从大到小为原花青素、姜黄素、柚皮素、槲皮素、维生素C.在低浓度（2 μmol/L）时，4种色素已能够抑制过氧亚硝酸根诱导酪氨酸氧化损伤，姜黄素、原花青素、槲皮素及柚皮素的抑制率分别达到了24.03%，50.80%，7.20%及20.99%，而同浓度的维生素C抑制率仅1.30%，其中微量的原花青素表现出良好的抗氧化活性，而槲皮素虽有报道显示其可以抑制ONOO-引起的鲁米诺化学发光反应和硝化反应[18]，但在抑制ONOO-氧化酪氨酸过程中，槲皮素的抗氧化活性不及其他几种天然色素.

2.3 几种色素对邻苯三酚自氧化的抑制作用

检测结束后，读取荧光动力学曲线拟合出的反应速率，按公式（3）计算天然色素对邻苯三酚自氧化的抑制能力，以色素浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，见图3.

式中：V0为未添加天然色素时邻苯三酚自氧化速率；Vs为添加天然色素时邻苯三酚自氧化速率.

结果表明，姜黄素、原花青素、槲皮素及柚皮素对邻苯三酚自氧化过程均具有不同程度的抑制作用.由图可知，随着几种色素的浓度不断增加，邻苯三酚自氧化速率不断降低，当浓度达到300 μmol/L时，姜黄素、槲皮素及柚皮素的抑制率分别为64.66%， 33.60%，19.88%，而同浓度的维生素C抑制率为10.66%，3种色素成分表现出良好的清除超氧根阴离子的能力.原花青素在此实验中未表现出良好的抑制作用，可能由于其以聚合物形式存在，在该体系中其空间结构影响了抗氧化活性[19].

3 结论

由上述试验可知，姜黄素、原花青素、槲皮素、柚皮素均具有良好的抗氧化、抗硝化能力，其中姜黄素的作用最为明显，其苯环上的酚羟基、甲氧基和β-双酮结构能够有效保护生物大分子免于过氧亚硝酸根的氧化、硝化损伤.姜黄素、槲皮素、柚皮素能够通过清除过氧亚硝酸根分解产生的超氧根阴离子实现其抗氧化功能，而原花青素由于其多聚物的存在形式，对超氧根阴离子的抑制效果并不明显.本文对探究食用色素成分在人体内的代谢、保健作用机理具有启示作用.本文分析方法对于成分复杂的食用色素-自由基体系可以进行准确分析，对于未来新型食品添加剂的抗氧化、抗硝化能力分析具有一定指导作用.

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