QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法测定牛奶中6种头孢菌素类抗生素残留

张小刚, 王 霞, 戴春风, 陈美莲(上海市农产品质量安全检测中心, 农业部食品质量监督检验测试中心(上海), 农业部奶产品质量安全风险评估实验室(上海), 上海 201708)

头孢菌素类药物是一种分子中含有头孢烯的半合成广谱类抗生素,具有临床治疗效率高、杀菌力强、过敏反应少、毒性低等优点,被广泛应用于兽医临床及畜禽饲养[1]。然而在畜禽饲养过程中,头孢类抗生素易被滥用而引起残留,对人类健康造成危害[2,3]。目前,测定头孢菌素残留量的分析方法主要有荧光分光光度法[4]、毛细管电泳法[5,6]、高效液相色谱法[7-11]和液相色谱-串联质谱法[12-15],使用较多的样品前处理技术有液液萃取法和固相萃取法。2003年,美国化学家Anastassiades等[16]提出了一种多残留快速、简单、便宜、高效、耐用和安全的前处理技术QuEChERS(quick, easy, cheap, effective, rugged, safe)。QuEChERS是基于分散固相萃取建立起来的,与传统的液液萃取、固相萃取等样品前处理技术相比,具有分析速度快、溶剂使用量少、操作及装置简单且回收率好、准确度高、成本低廉的优势。近年来,QuEChERS及其改进方法在农药残留、兽药残留及真菌毒素的检测中得到了广泛应用[17-22]。但是,目前采用QuEChERS前处理技术提取牛奶中头孢菌素类抗生素残留量的相关报道则较少。

本文将QuEChERS前处理技术与超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)结合,建立了一种简便、快速、准确同时测定牛奶中6种头孢菌素类抗生素残留量的分析方法。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

QTRAP®6500超高效液相色谱-串联质谱仪(美国AB Sciex公司); Heraeus Multifuge X1R高速冷冻离心机(美国Thermo Fisher Scientific公司); Reeko Auto EVA-20Plus全自动氮吹浓缩仪(睿科仪器有限公司); Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)。

乙腈(色谱纯,美国Thermo Fisher Scientific公司);醋酸(色谱纯,德国CNW公司);N-丙基乙二胺(PSA)、C18、NH2吸附剂(天津博纳艾杰尔科技有限公司)。6种头孢菌素抗生素标准品:头孢氨苄(cephalexin)、头孢匹林(cephapirin)、头孢噻肟(cefotaxime)、头孢唑啉(cefazolin)、头孢洛宁(cefalonium)、头孢喹肟(cefquinome),纯度不低于93.8%,购自德国Dr. Ehrenstorfer公司和加拿大TRC公司。

1.2 标准溶液配制

分别准确称取适量(精确至0.1 mg)6种头孢菌素抗生素标准品,用乙腈溶解,配制质量浓度为1 g/L的标准储备液,于-20 ℃保存;分别准确吸取1 mL标准储备液,置于100 mL容量瓶中,用乙腈稀释,配制质量浓度为10 mg/L的混合标准储备液,于-20 ℃保存;

准确吸取0.5 mL混合标准储备液,置于10 mL容量瓶中,用乙腈稀释,配制质量浓度为0.5 mg/L的混合标准中间溶液,于-20 ℃保存。

基质匹配标准溶液:采用1.3节样品前处理方法制备空白牛奶样品溶液,稀释混合标准中间溶液,制备质量浓度为10 μg/L的基质匹配标准溶液。

1.3 样品前处理

准确称取5 g(精确至0.01 g)牛奶样品,置于50 mL聚丙烯塑料离心管中,加入10 mL含1%(v/v)醋酸的乙腈溶液,涡旋混匀,超声提取10 min后,以8 000 r/min离心5 min,将上清液转移至另一50 mL聚丙烯塑料离心管中,于45 ℃水浴氮吹至低于5 mL,然后用水定容至5 mL,涡旋混匀1 min。取2 mL提取液,置于15 mL聚丙烯塑料离心管中,加入100 mg C18吸附剂,涡旋混匀,以5 000 r/min离心5 min,上清液经0.22 μm有机滤膜过滤至进样瓶中,供UPLC-MS/MS分析。

1.4 色谱条件

色谱柱:Waters HSS T3柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm);柱温:30 ℃;流动相:A为0.1%(v/v)甲酸水溶液,B为乙腈;流速:0.5 mL/min。梯度洗脱程序:0～0.2 min, 5%B; 0.2～2.5 min, 5%B～95%B; 2.5～3.0 min, 95%B; 3.0～3.1 min, 95%B～5%B; 3.1～5.0 min, 5%B。进样体积:5 μL。

1.5 质谱条件

电喷雾电离(ESI)源,正离子扫描;多反应监测(MRM)模式;离子源温度(TEM): 450 ℃;喷雾电压(IS): 5 500 V;气帘气(CUR)压力:276 Pa;雾化气(GS1)压力:379 Pa;辅助加热气(GS2)压力:448 Pa;射入电压(EP): 10 V;碰撞室射出电压(CXP): 10 V。6种头孢菌素类抗生素的其他质谱采集参数见表1。

表 1 6种头孢菌素类抗生素的质谱参数Table 1 MS parameters of the six cephalosporins

* Quantitative ion.

图 1 在MRM模式下头孢菌素类抗生素基质匹配标准溶液(10 μg/L)的色谱图Fig. 1 Chromatograms of the six cephalosporins in a matrix-standard solution (10 μg/L) in MRM mode

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

头孢菌素类抗生素属于极性化合物,常用的色谱柱为C18色谱柱,本实验选用了在反相条件下对极性化合物分离效果更佳的Waters HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)。

乙腈和水组成的流动相具有较好的溶解性。使用ESI源时,流动相中加入适量的甲酸可以提高样品的离子化效率。本实验选用0.1%(v/v)甲酸水溶液-乙腈为流动相,并优化了梯度洗脱程序,使头孢菌素类抗生素有较好的响应值与峰形。6种头孢菌素类抗生素基质匹配标准溶液(10 μg/L)在MRM模式下的色谱图见图1。

2.2 质谱条件的优化

在ESI+模式下分别对0.5 mg/L的6种头孢菌素类抗生素混合标准溶液进行质谱扫描分析,得到每种化合物的分子离子峰[M+H]+,以分子离子为母离子,对其进行二级质谱扫描,优化每种化合物母离子和子离子所需的碰撞能量和锥孔电压。优化后的质谱参数见表1。

2.3 提取试剂的优化

采用QuEChERS技术进行兽药残留测定时,乙腈或酸化乙腈是常用的提取溶剂。本实验选择含醋酸的乙腈溶液作为提取剂,并对提取液中醋酸的体积分数(0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、5.0%)进行了优化。在阴性牛奶样品中添加6种化合物的混合标准溶液,添加水平为10 μg/kg,按本实验建立的方法进行处理分析,结果见图2。由图2可知,采用含1%(v/v)醋酸的乙腈溶液提取时6种目标化合物的平均回收率为80.9% ～88.0%,结果优于其他酸度的提取剂。因此,本实验选用含1%(v/v)醋酸的乙腈溶液作为提取剂。

2.4 净化条件的优化

图 3 C18吸附剂的含量对目标化合物回收率的影响Fig. 3 Effect of the content of C18 adsorbents on the recoveries of the target compound

QuEChERS技术中常用的吸附剂有C18、PSA、NH2、石墨化炭黑(GCB)等吸附剂。C18对非极性物质有较大吸附,油脂去除效果显著;PSA、NH2可以有效去除有机酸、糖等极性物质;GCB可以吸附色素。根据牛奶基质的特点,本实验比较了C18、PSA、NH2吸附剂的吸附效果。结果表明,相较于PSA和NH2吸附剂,C18具有更好的吸附效果,故选用C18作为本实验的吸附剂。此外,进一步考察了不同吸附剂用量(50、100、200、500和1 000 mg)对6种头孢菌素类抗生素回收率的影响(见图3)。由图3可知,当C18用量为100 mg时,6种头孢菌素类抗生素的回收率最高,因此选为实验所用。

2.5 基质效应的评价

基质效应主要是由于样品在离子化时基质成分与目标化合物相互竞争电离所致,包括基质增强效应和基质抑制效应。在LC-MS/MS定性定量分析中,基质效应会对仪器的灵敏度和重复性产生影响,进而影响检测结果的准确性。本实验采用(基质匹配标准曲线的斜率/溶剂标准曲线的斜率-1)×100%的计算方法对6种头孢菌素类抗生素的基质效应进行评价[23]。当结果为正值时表示基质增强效应,为负值时表示基质抑制效应,绝对值越大则基质效应越强,通常认为,基质效应在±20%内为不显著[24]。由表2可以看出,除头孢匹林外,其余5种头孢菌素类抗生素均存在不同程度的基质效应,且基质抑制效应多于基质增强效应。为了能更准确地测定目标化合物,本实验采用基质匹配标准曲线来消除基质效应。

2.6 线性关系、检出限与定量限

采用空白样品基质提取液配制质量浓度为2、5、10、20、50和200 μg/L的系列混合标准溶液,以质量浓度(x, μg/L)为横坐标、峰面积(y)为纵坐标绘制标准曲线,得到各目标化合物的线性回归方程和相关系数(r)。结果表明,6种目标化合物在2～200 μg/L范围内呈良好的线性关系,r为0.999 6～0.999 9(见表2)。以3倍和10倍信噪比(S/N)确定各化合物的检出限(LOD)和定量限(LOQ),分别为0.2～0.6 μg/kg和0.8～2.0 μg/kg(见表2)。

2.7 回收率和精确度

取空白牛奶样品,分别添加3个浓度水平的6种待测物,每个浓度水平测定6份平行样品,考察方法的回收率和精密度,结果见表3。实验结果表明,6种目标化合物在3个加标水平下的平均回收率为75.1%～94.4%,相对标准偏差(RSD)为0.6%～8.3%。

2.8 实际样品测定

采用本实验所建立的方法,对购自超市的10份牛奶样品进行检测。结果表明,所有牛奶样品中均未检出6种头孢菌素类抗生素。

表 2 6种目标化合物的线性范围、回归方程、相关系数、检出限、定量限和基质效应Table 2 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients (r), limits of detection (LODs),limits of quantification (LOQs) and matrix effects of the six target compounds

y: peak area;x: mass concentration, μg/L.

表 3 6种头孢菌素类抗生素的平均回收率和相对标准偏差(n=6)Table 3 Average recoveries and RSDs of the six cephalosporins (n=6)

3 结论

本文结合QuEChERS前处理技术,建立了超高效液相色谱-串联质谱检测牛奶中6种头孢菌素类抗生素的方法。该方法操作简便,快速准确,灵敏度和精密度均能达到多残留检测技术的要求,为保障食品安全提供了技术支持。

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